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Estudo das alterações das citocinas inflamatórias na rejeição aguda do transplante intestinal em ratos EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGYINTRODUÇÃO No decorrer dos últimos 20 anos presenciou-se grande entusiasmo em relação aos transplantes de órgãos(34, 47, 59, 60) em decorrência do surgimento das novas drogas imunossupressoras (ciclosporina(7), FK 506(23, 39, 58, 67) rapamicina (55)). Diferentemente do transplante de órgãos sólidos(55, 69) (fígado, rim, coração), o do intestino ainda enfrenta grandes obstáculos referentes ao controle imunológico e seu prognóstico continua insatisfatório. Em alguns pacientes resta como última opção terapêutica o transplante intestinal(13, 18, 34, 47, 61), incluindo os doentes portadores da síndrome de intestino curto (SIC)(17), principalmente aqueles nos quais não se pode mais contar com acesso venoso central e os portadores de graves distúrbios metabólicos com o uso da nutrição parenteral prolongada (NPT)(54).

O uso crônico da NPT para tratar a falência intestinal na SIC provoca morbidade importante, acarretando complicações na cateterização venosa, tais como: infecção, sepse, trombose venosa, perda repetida de acesso venoso, além de baixa qualidade de vida pela dependência contínua de atenção de terceiros, internações freqüentes, distúrbios psicológicos e elevado custo de tratamento.

A mortalidade pode atingir de 5% a 25%(8, 9, 16, 24) ao ano. O emprego de NPT prolongada é também causa de falência de diversos órgãos, principalmente do fígado por colestase hepática. Em decorrência de suas graves conseqüências em outros aparelhos e órgãos, freqüentemente, o transplante intestinal é realizado combinado com o de fígado(8, 9, 16, 24).

No Brasil, foram realizados, no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP), dois casos pioneiros de transplante intestinal por Okumura na década de 60(43). Nessa Faculdade realiza-se pesquisa experimental de transplante de intestino delgado (TID) desde 1971, visando sua aplicação clínica(12, 14, 62). Recentemente realizou-se na Santa Casa de Misericórdia de São Paulo o primeiro TID, introduzindo entre nós o emprego de FK-560(6) para evitar a rejeição nessa modalidade de transplante.

Os pacientes com indicação do TID se distribuem em três categorias: pacientes com falência apenas do intestino, que não mais podem ser mantidos em NPT e recebem TID isolado, pacientes com FI associada à doença hepática avançada, que recebem TID combinado ao transplante hepático, e pacientes com falência de vários órgãos abdominais, que necessitam de transplante multivisceral (2, 16, 19, 26, 27, 59, 66).

O presente estudo foi idealizado para se ampliar o conhecimento sobre métodos de diagnóstico precoce da rejeição intestinal. O reconhecimento de rejeição é difícil, porém, importante pela possibilidade da reversão desse fenômeno biológico, dependendo de seu grau e da precocidade de seu diagnóstico, desde que se faça uso adequado de imunossupressores antes da perda definitiva do enxerto intestinal(31, 53).

Devido à ausência de marcadores sorológicos especifícos, bem como de quadro clínico específico, resta aos cirurgiões recorrer aos recursos de diagnóstico histológico por meio das biopsias. O processo da rejeição manifesta-se histologicamente sob forma de placas distribuídas de maneira descontínua no enxerto intestinal, sendo necessárias várias biopsias de três a cinco amostras por sítio, na tentativa de se obter amostra representativa que permita se firmar o diagnóstico(68). Mesmo com a análise criteriosa da correlação entre as alterações histológicas e rejeição, a positividade do diagnóstico corresponde a apenas 60%*.

Neste estudo foi avaliado o comportamento da liberação de algumas citocinas(15, 20, 21, 57, 63, 64) no tecido transplantado, que poderia ser relacionado ao fenômeno da rejeição aguda.

As citocinas são reguladores da resposta imune e inflamatória. Estão diretamente envolvidas com a proliferação e diferenciação das células da medula óssea e progenitoras dos leucócitos. Encontram-se em grande escala como proteínas solúveis no tecido local afetado e são secretadas diretamente pelas células-alvo. Em relação aos transplantes de órgãos, a expressão e a função das citocinas em cadeia têm atraído a atenção de vários pesquisadores com dois objetivos: primeiro, o diagnóstico precoce da rejeição e segundo, a possibilidade de se elaborar novos imunossupressores(39, 40).

Visto que o fenômeno da rejeição do enxerto se assemelha ao processo inflamatório, parece ser útil o estudo do papel das citocinas interleucina-6 (IL-6) e interferon-gama (IFN-g), especificamente devido a sua manifestação expressiva em pesquisas voltadas à compreensão de outras formas de reação imunológica(15, 20, 21, 57, 63, 64).

Portanto, o objetivo do presente estudo experimental em ratos submetidos a alotransplante intestinal, foi avaliar o comportamento das citocinas IL-6 e IFN-g, no diagnóstico precoce da rejeição aguda.

MÉTODO Animal de Experimentação Empregou-se o modelo de transplante intestinal em ratos isogênicos das raças Brown Norway e Lewis, sendo 24 animais machos da raça Brown Norway e 40 animais machos da raça Lewis, com o peso entre 200 a 350 g, distribuídos aleatoriamente, sem prévia seleção ou análise de qualquer parâmetro clínico- laboratorial para quaisquer dos grupos estudados. Os animais Brown Norway foram apenas doadores do intestino delgado e os da raça Lewis, 8 doadores e 32 receptores. Os animais foram anestesiadas com pentobarbital (65 mg/kg) e atropina (0,04 mg/kg) via intraperitonial, seguida de anestesia inalatória com halotano 2% associado a oxigênio (2,5 L/min).

Os animais foram distribuídos em dois grupos, a saber: Grupo isotransplante (C) É o grupo controle (C), constituído por oito animais receptores da raça Lewis submetidos ao isotransplante. O mesmo animal foi submetido a duas biopsias e posteriormente ao sacrifício nos seguintes momentos: Momento C(3) - Os oito animais receptores foram submetidos a biopsia intestinal no terceiro dia pós-operatório (PO3).

Momento C(5) Os oito animais foram submetidos a biopsia intestinal no quinto dia de pós-operatório (PO5).

Momento C(7) - Os oito animais foram sacrificados no sétimo dia de pós- operatório (PO7).

Grupo Alotransplante (Tx) Constituído por 24 animais receptores da raça Lewis e 24 animais doadores da raça Brown Norway, distribuídos em três subgrupos descritos a seguir: Subgrupo Tx(3) - Oito animais receptores da raça Lewis submetidos ao alotransplante e que foram sacrificados no terceiro dia de pós-operatório (PO3).

Subgrupo Tx(5) - Oito animais receptores da raça Lewis submetidos ao alotransplante e que foram sacrificados no quinto dia de pós-operatório (PO5).

Subgrupo Tx(7) - Oito animais receptores da raça Lewis submetidos ao alotransplante e que foram sacrificados no sétimo dia de pós-operatório (PO7).

Procedimento cirúrgico O transplante intestinal foi executado de forma heterotópica (Thiry-Vella) segundo a técnica de LEE(31), ZHONG(71, 72) e MONCHICK-RUSSELL(37). Não foi utilizada nenhuma forma de imunossupressão (Figura_1)

Imunoistoquímica O estudo imunoistoquímico foi realizado pela técnica da estreptavidina-biotina peroxidase utilizando-se: a) anticorpo para IFN-g (Rat IFN-g Affinity Purified Polyclonal Antibody, RD Systems, EUA), b) anticorpo para IL-6 (Rat IL- 6 Affinity Purified Antibody, RD Systems, EUA).

A avaliação da leitura foi realizada por dois investigadores (UR, ADWL), quantificando-se a intensidade e a distribuição das citocinas em todo corte transversal intestinal presente no corte histológico da lâmina. Seguiu-se método semiquantitativo numa escala de 0 a 4 para intensidade e distribuição, já descrita anteriormente(48, 50, 51)(Figuras_2, 3, 4).

Análise estatística Os dados foram confrontados com a curva de Gauss (curva normal) e classificados em não-paramétricos (para P <0,05).

Os dados foram analisados de duas formas: intragrupo (dentro de cada grupo de estudos) e intergrupo (comparando os grupos em momentos diferentes).

Na análise intragrupo no grupo isotranplante (C) foi realizado o teste de Friedmann com pós-teste de Muller-Dunn (o mesmo animal em diferentes momentos) e no grupo alotransplante (Tx), o teste de Kruskall-Wallis com pós-teste de Muller-Dunn (animais diferentes em momentos diferentes).

Na análise transversal intergrupo entre os grupos C e Tx foi utilizado o teste de Mann-Whitney.

Os dados foram expressos em mediana e percentil 25 e 75.

RESULTADOS Avaliação da IL-6 No Grupo C Na análise da IL-6 do grupo C, entre os momentos C(3), C(5) e C (7), não houve diferença estatística entre os mesmos. O grau da IL-6 variou de 0 a 4, segundo sua distribuição e intensidade de coloração, adotada na metodologia.

No Grupo Tx Na análise da IL-6 intragrupo do grupo Tx entre os subgrupos Tx (3), Tx(5) e Tx(7), houve aumento do grau desta citocina de modo marcante do Tx (3) para Tx(7). O mesmo ocorreu do subgrupo Tx(5) para Tx(7) com diferença estatística, porém de forma menos acentuada. Enquanto que do subgrupo Tx(3) para Tx(5) nada ocorreu.

Avaliação intergrupo entre o grupo C e Tx Na análise da IL-6 intergrupo entre os momentos do grupo C e os subgrupos do grupo Tx, de forma pareada e transversal, observou-se diferença estatística a partir do quinto dia de pós- operatório (C(5) e Tx(5)) com progressão até o sétimo dia de pós operatório (C (7) e Tx(7)). Porém, em todos os momentos, o grau IL-6 no grupo Tx foi maior em relação ao grupo C (Gráfico_1).

Avaliação do IFN-g No grupo C Na análise do IFN-g do grupo controle entre os momentos C(3), C(5) e C(7), observou-se diferença estatística apenas entre os momentos C(5) para C (7), caracterizado pelo aumento do grau do IFN-g.

No grupo Tx Na análise do IFN-g no grupo Tx, observou-se diferença estatística marcante no subgrupo Tx(3) para Tx(7), caracterizado pelo aumento do grau do IFN-g.

Avaliação intergrupo entre os grupos C e Tx Na análise da IFN-g intergrupo entre os momentos do grupo C e Tx, de forma pareada e transversal, observou-se diferença estatística marcante a partir do quinto dia de pós-operatório (C(5) e Tx(5)), com progressão até o sétimo dia de pós-operatório (C(7) e Tx(7)). Nota- se que em todos os momentos o grau IFN-g no grupo Tx foi maior em relação ao grupo C (Gráfico_2).

DISCUSSÃO A vantagem do modelo heterotópico usado nesta pesquisa está na nutrição do animal ser independente da função do intestino enxertado. Sua grande desvantagem é não corresponder ao transplante clínico, devido à participação do intestino transplantado no trânsito intestinal(31, 71, 72). Portanto, no modelo ortotópico, o enxerto fica exposto a vários antígenos externos com alteração do sistema de defesa da mucosa intestinal, afetando a população de linfócitos e ativando a população celular local. Quanto à drenagem venosa (portal versus sistêmica), mostra-se controversa, mas parece que a drenagem portal tem vantagem, oferecendo proteção ao enxerto intestinal pelo tráfego de linfócitos para o fígado(35, 71, 72).

Muitas citocinas apresentam meia-vida curta e exercem seus efeitos localmente, portanto seus níveis em nível sorológico não correspondem a evento ocorrido no enxerto intestinal(35).

Várias citocinas estão implicadas na rejeição do enxerto intestinal, uma vez que o processo da rejeição corresponde ao mecanismo inflamatório. As pró- inflamatórias incluem fator de necrose tumoral-a (TNF-a) e interleucina-1 (IL- 1)(3). Os linfócitos T auxiliares -1 (TH-1) produzem IL-2, IFN-g e linfotoxina (TNF-b), ao passo que os linfócitos auxiliares-2 (TH-2) produzem IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. As citocinas dos TH-1 podem ser detectadas na rejeição do enxerto e DEVH agudo em estudo experimental e clínico. As citocinas do TH-2 estão ligadas a situações de rejeição e DEVH crônico(4, 70).

Para entender as alterações histológicas e das citocinas no processo da rejeição, é essencial a compreensão da complexa população de linfócitos no intestino delgado. O tecido linfóide intestinal associado (GALT), serve como primeiro mecanismo de defesa frente a vários antígenos externos provenientes da ingestão alimentar. Sabe-se que há diferença funcional e fenotípica entre células linfóides das placas de Peyer, lâmina própria e linfócitos intraepiteliais. Apesar dos linfócitos T serem abundantes no intestino normal em ratos, os linfócitos B e células dendríticas parecem ser células mais importantes apresentadoras de aloantígeno(33). Os linfócitos intraepiteliais, por si só, não ativam os linfócitos T, mas aumentam durante o processo de rejeição(42), parecendo receber co-estimulação dos macrófagos do receptor e permitindo sua participação na ativação da invasão dos linfócitos T(32).

Há evidência de que os mediadores de rejeição no TID é composta por população heterogênea de células com tráfego simultâneo entre linfócitos do hospedeiro e do enxerto(30). Nas descrições clássicas, as células envolvidas no processo da rejeição dão ênfase à população dos linfócitos T(56), apesar de na rejeição do TID, os macrófagos também apresentarem papel importante neste mecanismo.

CLARK et al.(5) e HELL et al.(22) demonstraram que no TID em ratos apresentam 50% da mucosa do enxerto infiltrado por macrófagos do hospedeiro e grande número destes infiltrando a submucosa e muscular. Segundo os alguns autores(10, 41, 65), há grandes alterações na IL-6, TNF-a, e IFN-g neste modelo de rejeição, originadas principalmente, dos macrófagos e monócitos. Neste estudo foi avaliado apenas a IL-6 e IFN-g, excluindo-se o TNF-a, apesar de ser mediador importante(44, 52) que amplia o antígeno classe I do complexo de histocompatibilidade principal (MHC) do endotélio(29).

Nesta pesquisa não se optou pela contagem de células positivas por somatória de campos preconizado por REIS et al.(45, 46) devido ao grande número de células positivas por campo, o que causou dificuldade na contagem destas à microscopia óptica, com aumento de 400x. Portanto, foi adotada apenas a leitura por contagem de distribuição das células positivas(48, 50, 51).

A análise das citocinas em tecido intestinal transplantado é ainda controverso e pouco estudado(35). A maioria dos autores que estudou a IL-6 o fez pelo método da reação em cadeia da polimerase por transcriptase reversa (rtPCR)(14, 15, 20, 35, 63, 64), caracterizada pela alta sensibilidade na detecção de citocinas em relação ao método imunoistoquímico preconizado por FORBES(11), que se assemelha ao método utilizado neste estudo.

Optou-se neste trabalho pela avaliação imunoistoquímica em tecido parafinado pela clareza da leitura que foi proporcionada em relação ao tecido congelado.

A IL-6 é produzida pelos monócitos, células B, células T, células endoteliais, queratinócitos e fibroblastos. A IL-6 pode ser induzida pelo IL-1, TNF-a e TNF- a com IFN-g e pode ter importância na doença do enxerto versus hospedeiro, estimulando a diferenciação e proliferação das células B e T(1, 28).

Não houve diferença estatística entre os subgrupos do grupo-controle, em concordância com os achados de outros autores(14, 15, 20, 28, 63, 64), observando-se baixo grau de IL-6, o que caracteriza a ausência da rejeição.

No grupo Tx houve aumento progressivo da IL-6 com diferença estatística no decorrer do pós-operatório, correlacionando-se com a progressão da rejeição.

As alterações histológicas e das citocinas no processo da rejeição estão intimamente relacionadas às células imunocompetentes do sistema GALT, que garante a defesa contra os antígenos do meio ambiente(37, 38, 63).

Os linfócitos intra-epiteliais que vão aumentando em número na rejeição, recebem a co-estimulação dos macrófagos do receptor, desencadeando a ativação das células T(35, 63). A IL-6 derivada principalmente dos macrófagos e monócitos, promove o crescimento e diferenciação dos macrófagos e monócitos e pode ser induzida pela IL-1, TNF-a e TNF-a com IFN-g(35, 36).

Neste estudo ocorreu progressão da diferença estatística a partir do PO5 até o PO7 entre o grupo C e Tx, em concordância com o observado por vários autores estudados(20, 21, 28, 35, 63, 64). Embora se tenha utilizado do método imunoistoquímico em tecido parafinado, não houve dificuldade na imunoexpressão da IL-6 no presente estudo.

McDIARMID et al.(35) observaram aumento da IL-6 a partir do PO5 no grupo alotransplantado, que aumentou progressivamente até o 14° dia PO em relação ao grupo isotransplantado.

HAYASHI et al.(20, 21) observaram aumento da IL-6 a partir do PO5 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotransplantado.

TOOGOOD et al.(63, 64) observaram aumento da IL-6 a partir do PO3 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotransplantado. O estudo da IL-6 foi realizado pelo método de rtPCR, analisando-se o linfonodo mesentérico e as placas de Peyer, que apresentam forte reação imunológica. Este modelo de análise fica inviável do ponto de vista clínico devido à impossibilidade de se obter linfonodo mesentérico, como também as placas de Peyer devido ao risco da perfuração intestinal.

KOIDE et al.(28)observaram aumento da IL-6 a partir do PO5 até o PO11 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotransplantado.

Comparou-se o presente estudo com os trabalhos de outros autores(20, 21, 28, 35, 63, 64), notou-se que a metodologia imunoistoquímica utilizada pareceu ser eficaz como indicador da rejeição aguda. Porém ao se avaliar a IL-6 com a histopatologia, parece que esta citocina não apresenta vantagens em relação à histopatologia na detecção precoce da rejeição aguda porque não encontraram-se alterações entre o grupo C e Tx no PO3. Vários estudos mostraram que as alterações histopatológicas da rejeição são evidentes a partir do PO5(37, 38, 71, 72). No entanto, no presente estudo, as alterações da rejeição já são presenciadas a partir do PO3, porém não de forma expressiva.

O IFN-g é conhecido como citocina regulatória e inflamatória, produzido principalmente por células T e NK, desencadeado pelo processo inflamatório da rejeição(1, 28) e induzido pelos antígenos de superfície classe I e II do MHC (49).

No grupo controle, houve aumento com diferença estatística do grau do IFN-g do subgrupo C(5) para C(7), embora não tenha ocorrido o fenômeno da rejeição, em contraposição ao observado por vários autores(20, 21, 28, 35, 63, 64) que não lograram demonstrar o aumento desta citocina nos isotransplantes.

Provavelmente, o grupo C, por ter sofrido várias biopsias na porção ileal, no PO7 a porção distal do enxerto poderia estar comprometida pelo processo inflamatório e pelos sucessivos traumas anteriores nesta região(25).

No grupo Tx, o aumento progressivo do grau de IFN-g no decorrer do pós- operatório, causado pelo fenômeno da rejeição, foi semelhante ao observado por vários autores pesquisados(28, 35, 63, 64).

A comparação entre o grupo C e Tx de forma pareada transversal demonstra com clareza a eficácia desta citocina como indicador da rejeição precoce. Neste estudo somente a partir do PO5 observou-se o aumento do IFN-g com diferença estatística do grupo Tx em relação ao grupo C.

Alguns autores têm observado alterações desta citocina mais precocemente: McDIARMID et al.(35) observaram aumento do IFN-g a partir do PO5 até o PO14 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotransplantado. HAYASHI et al.(20, 21) observaram aumento do IFN-g a partir do PO3 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotranplantado. TOOGOOD et al.(63, 64) observaram aumento do IFN-g a partir do PO1 por meio de rtPCR no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotranplantado. O tecido analisado foi o linfonodo mesentérico e as placas de Peyer que constituem o sistema GALT apresentando forte reação imunológica. Todavia, este método é muito atraente para detecção precoce da rejeição em tecido fortemente imunocompetente: placas de Peyer e linfonodo mesentérico, porém, de aplicabilidade apenas experimental.

Outros autores observaram a elevação do IFN-g mais tardiamente:KOIDE et al.(28) observaram aumento do IFN-g a partir do PO5 no grupo alotransplantado em relação ao grupo isotranplantado.

Observa-se que o IFN-g é bom indicador da rejeição, porém, não melhor que a histopatologia, porque não foram encontradas alterações desta citocina no PO3 ao comparar o subgrupo C(3) com Tx(3). Mas a partir do PO5 observa-se diferença estatística expressiva entre os grupos analisados.

Pode-se concluir, dentro das condições de realização da presente investigação, que a detecção de interleucina-6 e IFN-g foram expressivas como marcadores da rejeição a partir do quinto dia de pós-operatório.