Expressão transiente do gene gus, sob regulação de quatro promotores, em
diferentes tecidos de mamoeiro (Carica papaya L.) e videira (Vitis sp.)
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICAO mamoeiro (Carica papaya L.) e a videira (Vitis vinifera L.) são cultivados em
quase todo o território nacional, apresentando importância tanto econômica como
social. O mamoeiro tem sua produção bastante limitada por vários patógenos,
cabendo destacar os de origem viral. A "mancha anelar do mamoeiro" é o
principal problema fitossanitário desta cultura no mundo, sendo causada por um
vírus, o Papaya ringspot virus (PRSV). Diversas estratégias já foram aplicadas
visando ao controle desta doença (Isherwood, 1992; Rezende & Costa, 1993;
Yeh & Gonsalves, 1994), porém nenhuma possibilita um controle amplo e
duradouro. Nesse sentido, o desenvolvimento de mamoeiros transgênicos
resistentes a vírus tem uma grande importância. Mamoeiros transgênicos
resistentes ao PRSV, expressando o gene da capa protéica deste vírus, já foram
obtidos (Fitch et al., 1992; Cai et al.,1999; Souza Jr., 1999), e duas
variedades já se encontram no mercado (Gonsalves, 1998). O domínio da
tecnologia de transformação genética de mamoeiro abre a possibilidade de
adicionar novos valores agregados a esta cultura, tais como resistência a
fungos, vida de prateleira mais longa, etc. No caso da videira, as doenças
fúngicas são responsáveis por perdas substanciais em produtividade e qualidade
do fruto. O uso de cultivares resistentes obtidas por melhoramento genético
convencional tem sido uma das principais formas de controle de pragas nesta
cultura. Porém, devido ao seu longo ciclo vegetativo (2-3 anos), esses
programas de melhoramento necessitam de um longo período para o desenvolvimento
de novas variedades (Camargo et al., 1999). Nesse sentido, a engenharia
genética apresenta-se como uma ferramenta promissora para o desenvolvimento de
cultivares resistentes. Vários sistemas-modelo para transformação de videira já
foram estabelecidos (Kikkert et al., 1997), podendo ser aplicados para o
melhoramento de variedades comercialmente importantes.
Um dos principais fatores que limitam o desenvolvimento de plantas transgênicas
em países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, é a dependência do uso de
produtos ou processos biotecnológicos que se encontram sob proteção intelectual
ou patentes. Dentre estes, cabe destacar os promotores de expressão, que são
regiões regulatórias de genes necessárias à transcrição dos mesmos. Um dos
promotores mais utilizados em biotecnologia de plantas é o 35S do Cauliflower
mosaic virus (CaMV) (Benfey & Chua, 1990), que confere uma alta taxa de
expressão na maioria das células quando transferido para plantas. Porém, este
promotor é patenteado, o que demanda, quando do seu uso em plantas transgênicas
que visam ao mercado, negociação para obtenção de licenciamento para uso
comercial.
O presente estudo objetivou comparar a expressão transiente da b-glucuronidase
(gus) sob regulação de três promotores de expressão gênica, em diversos tecidos
de mamoeiro e videira, tendo o promotor CaMV 35S como base comparativa. O gene
gus, isolado de Escherichia coli (Jefferson et al., 1986), é um gene repórter
bastante utilizado no estudo e monitoramento da expressão gênica,
principalmente no que diz respeito à especificidade de seqüências de promotores
(Gilissen et al., 1998).
Frutos, folhas, caules e raízes foram obtidos de mamoeiros 'Sunrise' coletados
no campo. Análises nos frutos, caule e raízes foram efetuadas tanto no tecido
da superfície quanto no tecido interno destes órgãos. Além destes tecidos,
foram utilizados embriões somáticos estabelecidos in vitro segundo Souza Jr.
(1999). Foram utilizadas folhas e caules de plantas de videira da variedade
copa 'Cabernet Sauvignon', e folhas, caules e raízes, do porta-enxerto
'Paulsen-1103', além de culturas de calos, previamente estabelecidas segundo
Martinelli et al. (1994), provenientes de cultura de tecidos de ovários.
As construções gênicas utilizadas foram: o plasmídeo pBI426 (Datla et al.,
1991), que contém o gene gus sob o controle do promotor CaMV 35S duplo (35S-
35S) (Benfey & Chua, 1990); o plasmídeo pAG1 (Aragão et al., 2000), que
contém o gene gus sob o controle do promotor do gene act2 de A. thaliana (Yong-
Qiang et al.,1996); o plasmídeo pUBQ3gus, que contém o gene gus sob o controle
do promotor do gene UBQ3 de A. thaliana (Callis et al., 1995); e o plasmídeo
pZSL11, que contém o gene gus sob o controle de um promotor constitutivo do
gene que codifica a enzima S-adenosyl-L-methionine synthetase (SAMS), a qual é
encontrada em plantas (http://l2.espacenet.com/dips/
viewer?PN=WO0037662&CY=ep&LG=en&DB=EPD).
Para a videira 'Cabernet Sauvignon', foram preparadas quatro placas para cada
tipo de tecido utilizado (folhas, caules e calos). Da mesma forma, para
'Paulsen-1103', foram preparadas quatro placas para cada tipo de tecido
(folhas, caules, raízes e calos). Para o mamoeiro, foram preparadas quatro
placas para cada tipo de tecido (embrião somático, folhas, fruto superfície,
fruto cortado, caule superfície, caule cortado, raiz superfície e raiz
cortada).
O método utilizado para a transformação dos tecidos foi de biobalística
(Sanford, 1990). O DNA utilizado foi preparado segundo Aragão et al. (1996) com
algumas adaptações. Cada placa foi bombardeada duas vezes, utilizando-se de 1
mg de DNA precipitado em 600 mg de micropartículas (M10) de tungstênio por
bombardeamento. O bombardeamento foi realizado em aparelho de biobalística com
o gás hélio sob pressão de 1200 psi. Após este, os explantes foram mantidos em
sala de crescimento (25º±2ºC e fotoperíodo de 16 horas de luz) por 24 horas.
Depois desse período, realizou-se o teste histoquímico, imergindo os explantes
em solução X-Glu [0.5 mg/ml 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl b-D-Glucuronide,
dissolvido em 10 mM EDTA, sal dissódico + 100 mM NaH2PO4.H2O + 0,5 mM K4Fe
(CN)6.3H2O + 0,1% Triton X-100]. Nessas condições, os explantes foram incubados
no escuro, a 37° C, por 16 horas. Depois desse período, analisou-se a presença
ou ausência de pontos de coloração azul nos diferentes tecidos.
A análise da expressão transiente considerou como resultado positivo todo e
qualquer tecido que apresentou uma ou mais células com coloração azul, após o
teste histoquímico em X-Glu. Pontos azuis foram observados em embriões e folhas
de mamoeiro (Figura_1) para todas as construções gênicas utilizadas (Tabela_1).
Expressão do gene gus, sob a regulação do promotor CaMV 35S e do terminador
nos, já foi relatada por Tennant (1996) em folhas obtidas de plântulas de
mamoeiro transgênico oriundas de sementes. A expressão transiente do gene gus
na superfície do fruto do mamoeiro foi observada para todas as construções
utilizadas, com exceção da pZSL11 (Tabela_1). No entanto, não foi possível
observar expressão deste gene na polpa do fruto, independentemente da
construção utilizada. Quando a expressão na superfície do caule foi avaliada,
pontos azuis foram observados com a maioria das construções testadas, com
exceção da construção pAG1. Da mesma forma que na polpa do fruto, nenhuma
expressão transiente foi observada no tecido interno do caule. Nenhum dos
promotores testados promoveu o aparecimento de sinais de expressão transiente
em tecidos de raiz de mamoeiro (Tabela_1). A inexistência de resultado positivo
de expressão transiente em tecidos internos de mamoeiro pode ser decorrente de
inibição da b-glucuronidase por proteases liberadas quando os tecidos foram
cortados.
Em relação aos diferentes tecidos testados para o mamoeiro, observou-se que não
houve diferença entre os plasmídeos pUBQ3gus e pBI426, que possibilitaram a
expressão do gene gus em embriões somáticos, folhas e superfícies de frutos e
caules. Estes resultados sugerem que o promotor do gene UBQ3 representa uma
real alternativa ao uso do promotor de CaMV 35S-35S em mamoeiro. Todos os
promotores promoveram a expressão em embriões somáticos. Tecidos embrionários
são normalmente empregados para a seleção in vitro de plantas transgênicas de
mamoeiro (Cai et al., 1999; Souza Jr. 1999). Estes resultados sugerem que
qualquer um dos promotores testados poderia ser utilizado para regular a
expressão de genes marcadores de seleção positiva de mamoeiros transgênicos.
Somente com a construção pZSL11, não foi possível observar a expressão
transiente do gene gus na casca do fruto. Devido a limitações metodológicas,
que não permitiram a obtenção de resultados conclusivos de expressão transiente
na polpa do fruto, não foi possível saber se a construção pZSL11 tem ou não a
mesma especificidade de expressão apresentada na superfície deste. A polpa do
mamão é consumida principalmente in natura, sem processamento. Um promotor com
expressão tecido-específica, que não se expressa na polpa do fruto teria um
considerável potencial de uso nesta fruteira e em outras fruteiras,
principalmente se o produto do transgene utilizado apresentasse limitações
quanto à segurança alimentar; isto é, toxidez ou alergenicidade. Estudos
complementares fazem-se necessários, principalmente no que se refere à
expressão estável do gene gus nos diversos tecidos do fruto, para que se tenha
uma análise mais completa da expressão destes promotores em tecidos do fruto.
Para 'Paulsen 1103', resultados positivos de expressão transiente do gene gus
foram obtidos em caules (Figura_1) e raízes, mas não nos demais tecidos
testados. Somente a construção pAG1 não apresentou expressão deste gene em
nenhum tecido de videira testado. Nas raízes, pontos azuis foram observados
quando estes tecidos foram bombardeados com as construções pBI426 e pZSL11, mas
não com as demais (Tabela_1). Martinelli & Mandolino (1994) obtiveram
resultados positivos de expressão do gene gus, sob a regulação do promotor CaMV
35S e terminador nos em embriões somáticos secundários de Vitis rupestris S. O
porta-enxerto 'Paulsen 1103' é híbrido de V. Berlandieri e V. rupestris. Para
Vitis sp., o promotor mais utilizado em transformação genética é o CaMV 35S-35S
(Kikkert et al. 1997; Martinelli et al., 1994). As construções pBI426 e pZSL11
apresentaram a mesma especificidade para expressão transiente neste porta-
enxerto, o que sugere que este promotor pode representar uma alternativa ao
CaMV 35S-35S em transformação de videira.
Quando se trata de porta-enxertos, é importante que a expressão de um gene
inserido ocorra principalmente nos tecidos de raiz e de caule. Os resultados
obtidos revelam que o promotor do gene UBQ3 promoveu a expressão do gene gus
apenas em caules de videira (Tabela_1). Estudos complementares de expressão
estável, nos diferentes tecidos de videira, fazem-se necessários. Se estes
estudos revelarem a mesma especificidade de expressão para o promotor do gene
UBQ3, este não poderá ser utilizado quando objetivando características
dependentes de expressão na raiz, como, por exemplo, resistência a "margarodes"
(Eurizoccocus brasiliensis) ou a nematóides.
Para "Cabernet Sauvignon", resultados positivos de expressão transiente foram
observados apenas nos caules. Estes tecidos apresentaram pontos azuis, após o
teste histoquímico em X-Glu, quando bombardeados com as construções pBI426 e
pZSL11 (Tabela_1). Kikkert et al. (1997) reportam expressão transiente do gene
gus sob o controle do promotor CaMV 35S-35S, utilizando a construção pBI426
para o bombardeamento de células embriogênicas das variedades 'Merlot' e
'Chancellor'. No caso de variedades-copa, é importante que os promotores sejam
eficientes para promover a expressão em tecidos da copa, como folhas, caule e
frutos. Os resultados obtidos (Tabela_1) revelam que o promotor do gene UBQ3
não foi eficiente para promover a expressão em nenhum dos tecidos testados,
sendo, para tanto, menos eficiente em relação aos promotores que regulam o gene
gus em pBI426 e pZSL11.
Um dos principais tecidos atacados por doenças fúngicas na videira são as
folhas. Nenhum dos promotores utilizados no presente estudo permitiu a
expressão transiente do gene gus neste tecido. Expressão estável deste gene foi
observada em folhas, caules, raízes, anteras e ovários quando sob a regulação
do promotor CaMV 35S-35S (Kikkert et al., 1997). Estes autores relatam
expressão estável do gene gus nos tecidos da variedade-copa 'Chancellor'. A
não-expressão deste gene de forma transiente em folhas de 'Cabernet Sauvignon'
e 'Paulsen 1103' (Tabela_1) pode ser decorrente de limitações metodológicas ou
resultado de uma especificidade de expressão em nível de variedade. Estudos
complementares precisam ser realizados para melhor esclarecer este ponto.
Com base nos resultados obtidos, nas condições experimentais do presente
trabalho, pôde-se concluir que: a) o promotor do gene UBQ3 é uma alternativa
real ao CaMV 35S-35S para futuros trabalhos de transformação genética de
mamoeiro; b) o promotor SAMS mostrou-se como a melhor alternativa, dentre as
testadas, ao CaMV 35S-35S, para futuros trabalhos de transformação genética de
videira.
