Ação antagônica de rizobactérias contra Phytophthora parasitica e p.
citrophthora e seu efeito no desenvolvimento de plântulas de citros
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
A podridão radicular dos citros (Citrusspp.), causada por Phytophthora
parasitica(Dastur) Waterhouse e P. citrophthora (Smith & Smith) Leon., é
uma doença que pode provocar perdas significativas em viveiros de todas as
regiões citrícolas. Segundo Feichtenberger (1990), o índice de contaminação em
viveiros é alto e vem agravando-se diante da substituição de porta-enxertos, em
virtude do aparecimento da tristeza (Citrus tristeza vírus) e do declínio
(Xylella fastidiosa). A importância da sanidade em sementeiras é bastante
significativa, mesmo quando o estoque da sementeira está destinado a áreas onde
o patógeno já está presente. O controle da doença é maior se a planta estiver
livre do patógeno no tempo do estabelecimento (Shea & Broadbent, 1983).
Atualmente, o controle de Phytophthora spp., nos viveiros, ainda é feito com
fumigantes (Feichtenberger, 1990). A microbiolização de sementes pode
constituir uma opção potencial para o controle de fitopatógenos habitantes do
solo, bem como para diminuir os problemas ambientais decorrentes do uso de
produtos químicos no ambiente (Luz, 1993).
Microrganismos antagonistas do gênero Bacillus e Pseudomonas têm sido avaliados
como um meio de controlar podridões radiculares causadas por Phytophthora spp.
em eucalipto (Malajczuk et al., 1977) e soja (Sneh et al., 1977), pois, além de
residirem no solo, rizoplano e filoplano, apresentam boas características para
os estudos de controle biológico de doenças de plantas.
Em vista disso, cogitou-se a possibilidade de utilização de bactérias
antagonistas a P. parasitica e P. citrophthorana cultura dos citros, dado o
potencial destas de colonizarem o sistema radicular e atuarem como uma barreira
à penetração do patógeno. Este trabalho teve como objetivo verificar o
potencial de rizobactérias no tratamento de plântulas de citros para o controle
da podridão de raízes em viveiros.
Amostras de solo foram coletadas a partir de solo aderido às raízes
provenientes de plantas de citros, localizadas em pomares com sintomas de
Phytophthora spp. Suspensões de solo em solução salina (0,85% NaCl), na
proporção de 1g/9ml, foram agitadas por um minuto em agitador vortex e por 20
segundos em ultra-som. Diluições em série foram feitas até 10-7 e alíquotas de
0,1ml das três últimas diluições foram plaqueadas em meio B de King (KMB). As
culturas foram incubadas a 28ºC por cinco dias, em câmara de
crescimento, quando se procedeu a pulverização de uma suspensão de esporos de
Phytophthoraspp. sobre a superfície do meio onde as colônias de bactérias se
desenvolviam. As culturas foram incubadas por mais sete dias a 28oC, quando
foram identificadas colônias de bactérias manifestando zonas de inibição aos
fungos, as quais foram repicadas, purificadas em meio nutriente ágar (NA) e
armazenadas a 5oC.
Um isolado de B. subtilis (Ehrenb.) Cohn. e um de P. putida (Trev.) Mig.,
cedidos pela coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de
Fitopatologia da Embrapa Monitoramento Ambiental, foram incluídos aos ensaios,
por serem antagônicos a diversos patógenos do solo.
As suspensões bacterianas foram preparadas a partir de culturas com 48 horas de
crescimento em meio NA, sendo as células transferidas para tubos de ensaio com
10 ml de MgSO4 0.1M e mantidas sob agitação mecânica por 1 minuto. A
concentração das suspensões foi determinada pela comparação com a escala de
McFarland e ajustada para aproximadamente 109 células/ml. A cada suspensão, foi
adicionado o espalhante adesivo Tween 80, na concentração de 0,05%.
Foram utilizados um isolado de Phytophthora parasitica (P9) e um isolado de P.
citrophthora (P45), provenientes do Instituto Biológico (SP). No preparo do
inóculo, discos de cultura de Phytophthora em meio BDA foram repicados para
placas com meio V8-CaCO3 e incubados por 10 dias a 28ºC, em regime de
escuro contínuo, seguido da homogeneização com 200ml de água destilada.
Sete isolados de rizobactérias, selecionados em testes preliminares, foram
submetidos a três ensaios contra P. parasiticae P. citrophthora em meio BDA
(Batata-dextrose-agár), colocando-se um disco de ágar de 5mm de diâmetro com
crescimento abundante de Phytophthora a 1,5cm da borda da placa e na outra
extremidade uma estria da bactéria selecionada. Após oito dias de incubação a
28ºC e fotoperíodo de 12 horas, a redução do crescimento micelial foi
medida.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em arranjo fatorial,
com 14 tratamentos, constituídos pela combinação dos sete isolados bacterianos
e os dois isolados de Phytophthora, e três repetições. As testemunhas foram
constituídas por crescimento de discos de Phytophthora sem as bactérias.
Os dados originais do crescimento micelial de Phytophthoraspp. foram submetidos
a análise de variância, e as médias comparadas através do teste de Tukey, a 1%
de probabilidade.
Sementes de limoeiro-Cravo (Citrus limoniaOsbeck) foram desinfestadas em
solução de hipoclorito de sódio (NaClO 0.7%) por 5 minutos, lavadas em água
corrente e, após a secagem por 24 horas, à temperatura ambiente, foram imersas
nas suspensões bacterianas por 1 hora. As testemunhas consistiram de sementes
desinfestadas e imersas em solução de MgSO4 0.1M adicionada de Tween 80, sem a
presença de células bacterianas. Após a secagem por duas horas, as sementes
foram semeadas em substrato não esterilizado, constituído por solo/areia/
esterco de curral (2:1:1), infestado artificialmente com Phytophthora spp.
através do tratamento com 50 ml de suspensão/ kg de solo. Este ensaio foi
repetido duas vezes.
Quinze dias após a germinação, foi feita a avaliação da percentagem de
plântulas infectadas.
Utilizou-se um delineamento em blocos casualizados, com três repetições, sendo
32 plântulas por repetição. Os dados originais do número de plantas mortas
foram transformados em , onde x = porcentagem
de plantas infectadas, para efeito de análise estatística pelo teste de F, e as
médias foram comparadas através do teste de Tukey, a 1% de probabilidade.
Tratamentos-controle somente com as rizobactérias foram feitos a fim de
avaliar-se os efeitos das mesmas na promoção do crescimento de plântulas de
limoeiro-Cravo. Avaliou-se a matéria seca da parte aérea e das raízes das
plântulas, após dois meses de inoculação com as bactérias em substrato
esterilizado.
Utilizou-se um delineamento em blocos casualizados, com três repetições, sendo
32 plântulas por repetição.
Antagonismo "in vitro" de rizobactérias contra Phytophthora
Dos trinta e três isolados bacterianos testados, sete apresentaram atividade
antagônica à Phytophthora spp. em meio King's B, ou seja, 21,2% foram capazes
de inibir significativamente o crescimento micelial dos patógenos. Destacaram-
se RC2, OG, C1S/Na e C1-1B (Tabela_1 ), sendo selecionados para os testes
subseqüentes. Verificou-se que as bactérias introduzidas (OG e Santa Bárbara)
mostraram atividade antagônica igual ou superior a C2-8C e RA2. Estes
resultados indicam que as rizobactérias não apresentam especificidade de ação,
o que permite a sua utilização para diferentes sistemas planta-hospedeiro.
O teste de antagonismo in vitro foi realizado em meio de KMB para detectar a
produção de sideróforos. Acredita-se que pode ter ocorrido antagonismo tanto
pela produção de sideróforos (competição por ferro) como pela produção de
substâncias tóxicas (antibiose). Resultados semelhantes foram obtidos por Stein
(1988), que verificou a inibição de fungos de solo por Pseudomonas
fluorescentes, pelos mecanismos de antibiose e competição por ferro.
Antagonismos "in vivo" de isolados de rizobactérias contra Phytophthora spp.
Quando aplicados como tratamento de sementes, os isolados bacterianos diferiram
significativamente entre si quanto à capacidade de reduzir a doença (Tabela_2).
Os isolados OG, CiS/Na e C1-1B foram mais eficazes em controlar a doença, não
diferindo significativamente dos isolados Sta. Bárbara e RC2.
Estes resultados levam-nos a crer que os isolados de rizobactérias dos citros
são eficientescolonizadores de raízes, possivelmente pela capacidade de
crescimento e/ouhabilidade competitiva. Brown (1974) constatou que crescimento
rápido e competição são algumas das características necessárias ao sucesso do
estabelecimento na rizosfera.
Com relação às bactérias introduzidas nos experimentos, muitos trabalhos
ressaltam ogrande potencial de espécies de Bacillus no controle de patógenos do
solo. Meloet al. (1995) constataram que a linhagem OG de B. subtilis isolada do
rizoplano de feijoeiro, no município de Guaíra (SP), foi um potente antagonista
contra algunspatógenos de raízes de feijão, como F. solanif. sp.
phaseoliKendrick & Snyder,Rhizoctonia solanie Sclerotium rolfsii.
Promoção de crescimento induzido pelas rizobactérias
Com relação à promoção de crescimento, verificou-se que todos os tratamentos
promoveram o crescimento das plântulas de citros, tanto para raiz como para
parte aérea, quando comparados à testemunha (Figura_1). B. subtilis(OG e RC2),
Flavobacterium sp. (CiSNA) e P. putida(C1-1B e Sta. Bárbara) proporcionaram
melhores efeitos. Estes dados mostram que as rizobactérias estimulam o
crescimento direto das plantas na ausência de patógenos (Luz, 1993).
fig01
Várias hipóteses têm sido aventadas no sentido de explicar a capacidade que
possuem as rizobactérias de promover o crescimento das plantas. A maioria dos
trabalhos relaciona essa capacidade à inibição e alteração da microbiota normal
da rizosfera, fazendo com que a planta cresça com um sistema radicular sadio,
seja por antibiose (Brisbane & Rovira, 1988), seja ou pela competição por
nutrientes, destacando-se entre esses o ferro (Geels & Schippers, 1983) e o
carbono ( Elad & Chet, 1987). Os isolados Santa Bárbara e OG, que têm
promovido o crescimento de plântulas de pepino e tomate ( Melo et al., 1995),
comprovam, nesse trabalho, seu efeito benéfico na promoção do crescimento de
plantas de citros.
Conclui-se que Pseudomonas putida, biovares A e B, Flavobacterium sp. e
Bacillus. subtilis são capazes de controlar Phytophthora parasitica e P.
citrophthorae promover o desenvolvimento de plântulas de citros .
