Isolamento e eficiência de plaqueamento de protoplastos de citros
ISOLAMENTO E EFICIÊNCIA DE PLAQUEAMENTO DE PROTOPLASTOS DE CITROS1
INTRODUÇÃO
Programas de melhoramento de citros vêm sendo desenvolvidos desde o século
passado (Davies & Albrigo, 1994); entretanto, os métodos convencionais que
utilizam a hibridação sexual, têm apresentado pouco sucesso (Vardi et al.,
1982). Isto ocorre devido a aspectos da biologia reprodutiva dos citros, como
alta heterozigose, esterilidade do grão de pólen e óvulo, incompatibilidade
sexual, poliembrionia nucelar e juvenilidade (Vardi et al., 1975; Ling et al.,
1989, Grosser & Gmitter Junior, 1990a).
A partir da década de oitenta, com o avanço das técnicas de biotecnologia, a
hibridação somática pela fusão de protoplastos também passou a ser utilizada em
programas de melhoramento de citros, superando as barreiras genéticas impostas
à hibridação sexual, possibilitando a obtenção de alotetraplóides, os quais
combinam o genoma nuclear de ambos os parentais (Grosser & Gmitter Junior,
1990a).
Para o estabelecimento de um programa de hibridação somática, é necessário
desenvolver um protocolo de isolamento e cultivo de protoplastos in vitro, com
regeneração de plantas. Protoplastos de citros têm sido obtidos de tecido
foliar (Kobayashi et al., 1991; Saito et al., 1993) e de calos e células em
suspensão (Oliveira,1993), sendo estes os responsáveis pela regeneração de
plantas, utilizando-se de soluções enzimáticas constituídas de celulase e
pectoliase (Carneiro et al., 1998), dissolvidas em metade das concentrações dos
macronutrientes do meio MT (Murashige & Tucker, 1969), sais minerais de CPW
(Frearson et al., 1973) ou em ácido 2- [N-morfolino]- etanossulfônico (MES) e
NaH2PO4 (Grosser & Gmitter Junior, 1990b).
O primeiro isolamento de protoplastos de citros foi relatado por Vardi et al.
(1975), utilizando a cv. 'Shamouti' de Citrus sinensis. Vários são os
protocolos de isolamento de protoplastos de citros existentes na literatura,
como os descritos por Vardi et al. (1987), Kobayashi et al. (1983) e Grosser
& Gmitter Júnior (1990a). Embora algumas generalizações para obtenção de
protoplastos possam ser feitas, as condições necessárias para o isolamento
podem variar de espécie para espécie e até mesmo de variedade para variedade.
No que se refere ao cultivo de protoplastos, a densidade de plaqueamento bem
como a molaridade do meio de cultivo constituem-se os principais fatores da
eficiência final de plaqueamento, definida como a porcentagem de protoplastos
plaqueados que dividiram e formaram microcalos com 1-2 mm de diâmetro (Ochatt
& Power, 1992), com potencial de regeneração de plantas.
A eficiência de plaqueamento de protoplastos tem sido baixa, atingindo valores
menores que 1% em algumas espécies (Banks & Evans, 1976). Em trabalhos com
protoplastos de citros, a eficiência de plaqueamento tem sido de 3,6 a 9,0%
(Vardi et al., 1975) e de 0 a 35% (Grosser & Gmitter Junior, 1990b), e cada
espécie possui uma densidade mínima de plaqueamento abaixo da qual não ocorrem
divisões celulares (Carneiro et al., 1998).
Desta forma, este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de três soluções
enzimáticas no isolamento de protoplastos, bem como o efeito de diferentes
densidades de cultivo na eficiência final de plaqueamento para 11 variedades
cítricas.
MATERIAL E MÉTODOS
Cultivo de calos embriogênicos:Calos embriogênicos das laranjas-'Valência Rhode
Red', 'Ruby Blood', 'Pêra' cv. 158, 'Natal', 'Valência' e 'Succari' (Citrus
sinensis L. Osbeck); tangerinas-'Cleópatra' (Citrus reshni Hort. ex Tanaka),
'Sunki' (Citrus sunki Hort. ex Tanaka); limão-'Cravo' (Citrus limonia L.
Osbeck) e'Kinnow' (Citrus nobilisxCitrus deliciosa); e tangor-'Murcote' (Citrus
reticulata x Citrus sinensis) obtidas do cultivo de tecido nucelar, mantidos em
meio de cultura MT (Murashige & Tucker, 1969), modificado pela adição de
500 mg.L-1 de extrato de malte, em ausência de luz, à temperatura de 27 ± 1°C,
foram utilizados para isolamento de protoplastos. A cultura de calos
embriogênicos apresentou idade de aproximadamente 3 anos, com subcultivos a
cada 4 semanas.
Isolamento de protoplastos em função da solução enzimática: Foram utilizadas
três soluções enzimáticas: 1. Grosser & Chandler (1987), composta de 1%
celulase Onozuka RS (Yakult), 1% macerase R-10 (Yakult Honsha) e 0,2%
pectoliase Y-23 (Seishin); dissolvidas em solução de 0,7 M manitol, 24,5 mM
CaCl2.H2O; 0,92 mM NaH2PO4 e 6,15 mM de ácido 2-[N-morfolino]-etanossulfônico
(MES) (Grosser & Gmitter Junior, 1990a), utilizando-se de 2 mL desta
solução por 500 mg de calo, diluído em 2 mL de meio de cultura BH3 0,7 M
(Mourão Filho, 1995); 2. Kobayashi et al. (1983), constituída de 0,2 % celulase
Onozuka R-10, 0,3% de macerozyme R-10 e 0,1% driselase (Kyowa), dissolvidas em
solução com metade dos macroelementos do meio de cultura MT e 0,7 M de manitol,
pH 5,7, utilizando-se de 5 mL desta solução por 500 mg de calo, e 3. Ochatt et
al. (1987), composta por: 1% celulase Onozuka R-10; 0,2% macerase R-10 e 0,1%
driselase, dissolvidas em CPW 13 M (Freason et al., 1973) com 5 mM MES, pH 5,6,
utilizando-se de 10 mL da solução por 500 mg de calo. As soluções enzimáticas
foram esterilizadas por meio de filtração (0,22 mm). A incubação foi realizada
por um período de 10 horas, sob agitação orbital de 40 rpm, em ausência de luz,
à temperatura de 27 °C. Após digestão enzimática, os protoplastos foram
purificados em gradiente de sacarose-manitol e diluídos em 5 mL do meio de
cultura BH3 0,7 M. A avaliação dos resultados foi realizada com auxílio de
hemocitômetro, determinando-se o rendimento de protoplastos por peso fresco de
calo embriogênico utilizado. O delineamento experimental utilizado foi
inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 3 x 11, sendo cada repetição
constituída por uma placa de Petri com 500 mg de calo.
Densidades de plaqueamento no cultivo de protoplastos: Protoplastos purificados
foram cultivados em cinco densidades 2 x 104 ; 5 x 104; 105 ; 2 x 105e 3 x 105
protoplastos.mL-1, em meio de cultura EME 0,7 M em ausência de luz, a 25 ± 1°C
(Grosser & Gmitter Júnior, 1990a). Aos 30 dias de cultivo, iniciou-se a
redução da pressão osmótica, adicionando-se 10 a 12 gotas do meio de cultura 1:
1:1 (v:v:v), 1 parte de BH3 0,6 M, 1 parte de EME 0,6 M e 1 parte de EME 0,146
M, transferindo-se a cultura para baixa iluminação. Em subcultivos posteriores
(a cada 20 a 30 dias), quando a cultura de protoplastos já estava mais
vigorosa, formando microcalos, adicionaram-se às microcolônias o meio de
cultura 1:2 (v:v), o qual é composto por 1 parte do meio de cultura BH3 0,6 M e
2 partes de EME 0,146 M. Aos 90 dias de cultivo, foi avaliado o número de
microcalos com 1-2 mm de diâmetro, transferindo-os para placa de Petri (100 x
15 mm), contendo o meio de cultura semi-sólido EME suplementado com 25 g.L-1 de
sacarose, a qual foi dividida em 8 campos, para facilitar a contagem das
colônias. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado,
com 3 repetições, sendo cada repetição constituída por uma placa de isolamento.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Verificou-se influência da variedade e da solução enzimática no isolamento de
protoplastos (Tabela_1). Esses resultados já foram constatados por Mendes-da-
Glória (1998), Oliveira et al. (1994) e Latado (1998). Estas diferenças estão
relacionadas com características inerentes à parede celular, que, embora seus
constituintes básicos sejam os mesmos, sua composição pode variar muito entre
as espécies (Carneiro et al., 1998).
A comparação dos efeitos promovidos pelas três soluções enzimáticas permite
concluir que a solução descrita por Grosser & Chandler (1987) foi a mais
eficiente no isolamento de protoplastos de calos, em que diversas variedades
estudadas apresentaram bons resultados. O uso das soluções enzimáticas
descritas por Ochatt et al. (1987) e Kobayashi et al. (1983) resultaram em
suspensão de protoplastos com muitas impurezas e com baixo rendimento (número
de protoplastos.g de calo-1), mesmo em variedades responsivas em trabalhos
anteriores, tais como, as laranjas-'Natal', 'Ruby Blood' e 'Valência Rohde
Red'. O rompimento da membrana plasmática permite a liberação de compostos
fenólicos, que promovem a síntese anormal da parede celular, atraso nas
divisões e até morte das células, prejudicando, portanto, o cultivo de
protoplastos íntegros (Evans & Bravo, 1983).
Quanto à densidade de plaqueamento, verificou-se a formação de um maior número
de microcolônias nas densidades de 105 e 2 x 105 protoplastos.mL-1, o que pode
ser constatado pela eficiência de plaqueamento, a qual variou de 6% (tangerina-
'Kinnow') a 8,5% (tangerina-'Sunki') e de 7,2% (tangor-'Murcote') a 9,8%
(tangerina-'Cleópatra'), respectivamente (Figura_1). Estes resultados se
encontram dentro dos limites citados por Grosser & Gmitter Junior (1990b),
que variam de 0 a 35%, e por Vardi et al. (1975), que encontraram variações de
3,6 a 9,0%.
A eficiência de plaqueamento foi muito baixa nas densidades de plaqueamento de
2 x 104 e 5 x 104 protoplastos.mL-1 (Figura_1). Segundo Evans & Bravo
(1983), para cada espécie, existe uma densidade mínima de plaqueamento na qual
não ocorre divisão celular. Por outro lado, o incremento na densidade para 3 x
105 protoplastos.mL-1não mostrou comportamento linear. As pouquíssimas colônias
desenvolvidas cessaram o crescimento e, conseqüentemente, morreram aos 90 dias
após o início do cultivo. Resultados semelhantes foram obtidos por Vardi et al.
(1975), trabalhando com protoplastos da laranja-'Shamouti', na densidade de 4 x
105 protoplatos.mL-1. Em altas densidades, fenômenos de absorção e excreção dos
protoplastos podem modificar profundamente o meio de cultura (Carneiro et al.,
1998), ocorrendo acúmulo de substâncias tóxicas em níveis letais (Shain, 1985).
Após 5 a 8 semanas de cultivo, ocorreu formação de embriões somáticos,
espontaneamente, em algumas colônias desenvolvidas nas densidades de
plaqueamento de 105 e 2 x 105. A resposta embriogênica variou entre as
variedades estudadas (Tabela_2). Os maiores números de embriões somáticos foram
obtidos em laranjas-doces ('Ruby Blood', 'Rohde Red', 'Natal', 'Valência'). Não
foi observada a ocorrência de embriogênese somática em tangor-'Murcote'. O
efeito da cultivar na capacidade regenerativa foi relatado por outros autores
(Mendes-da-Glória, 1998; Benedito et al., 2000; Tomaz et al., 2001).
Possivelmente, estas diferentes respostas estão relacionadas com
características inerentes à composição da parede celular que, embora contenha
os mesmos constituíntes básicos, pode apresentar composição diferenciada
(Carneiro et al., 1998).
A histodiferenciação dos embriões somáticos de laranja-doce ocorreu de maneira
regular, tendo sido visualizados embriões somáticos em diferentes estádios de
desenvolvimento (globular, torpedo e cotiledonar).Estas diferentes fases de
desenvolvimento foram relatadas por Kunitake & Mii (1995) em laranja-
'Valência', após transferência de embriões somáticos em estádio globular para
meio enriquecido com giberelina, e por Perez et al. (1998) em várias cultivares
de citros.
Quanto às variedades de tangerinas, apenas a tangerina-'Cleópatra' apresentou
desenvolvimento dos embriões somáticos passando pelos estádios acima
mencionados. No entanto, alguns embriões anormais foram observados. Os embriões
somáticos formados nas variedades 'Kinnow' e 'Sunki' permaneceram em estádio
globular.
Os embriões somáticos desenvolvidos em calos de limão-'Cravo' encontraram-se em
estádio globular e partes deles com estrutura multicotiledonar. Resultado
semelhante foi relatado por Tomaz et al. (2001) ao estudarem a
histodiferenciação de embriões de citros in vitro.
Estudos envolvendo a regeneração de plantas via embriogênese somática in vitro
têm relacionado a baixa conversão em plantas com as anormalidades observadas
nos embriões somáticos. Dentre as alterações dos embriões somáticos observadas
por diversos autores, estas variam principalmente em relação à morfologia do
meristema apical caulinar e dos cotilédones (Passos et al., 1999; Fernando,
1999).
CONCLUSÕES
1. O rendimento de protoplastos é influenciando pela variedade e composição da
solução enzimática.
2. A eficiência final de plaqueamento variou em função da densidade de cultivo
dos protoplastos.
3. As melhores taxas de divisão celular e, conseqüentemente, formação de
colônias ocorreram nas densidades de plaqueamento de 105e 2 x 105
protoplastos.mL-1.
4. A intensidade da embriogênese somática foi dependente da variedade estudada,
variando em função da densidade de plaqueamento.
