Potencial organogenético de tecidos caulinares e radiculares de caquizeiro
POTENCIAL ORGANOGENÉTICO DE TECIDOS CAULINARES E RADICULARES DE CAQUIZEIRO1
INTRODUÇÃO
O caquizeiro é uma espécie originária da Ásia, sendo que o Japão é o maior
produtor mundial de caquis. Atualmente, o cultivo tem crescido muito fora da
Ásia, principalmente em países como os Estados Unidos, Israel, Itália, Brasil e
Nova Zelândia (Tao & Sugiura, 1992).
No Brasil, o caquizeiro é cultivado principalmente nas regiões Sudeste e Sul,
onde se destacam os Estados de São Paulo, Rio Grande do Sul e Paraná, citados
em ordem decrescente de produção. A área cultivada no Brasil atingiu 5.524 ha
em 1998, o que correspondeu a uma produção média de 604 milhões de frutos e um
valor de produção da ordem de R$ 48.454.000,00 (IBGE, 2000).
O caquizeiro é propagado usualmente através da enxertia por garfagem ou
borbulhia, sobre porta-enxertos oriundos de sementes (Martins & Pereira,
1989). Os porta-enxertos mais utilizados pertencem à própria espécie Diospyros
kakie às espéciesDiospyros virginiana e Diospyros lotus. Os porta-enxertos da
espécie D. kaki são obtidos das próprias variedades cultivadas no Brasil, tais
como Luiz-de-Queiroz, Giombo, Rama-Forte, Chocolate e Trakoukaki (Penteado,
1986).
Esta espécie apresenta grande dificuldade de enraizamento por meio de estacas
caulinares (Tao & Sugiura, 1992). Rubbo (1989) realizou uma série de
experimentos com a estaquia lenhosa e herbácea da cultivar Giombo, testando
diversas concentrações de AIB em imersão rápida e lenta, em diferentes épocas
do ano, não obtendo nenhuma estaca enraizada. Melhores resultados são obtidos
com estacas de raízes (Hartmann et al., 1990), conforme verificaram Boliani
& Sampaio (1988), com as cultivares Taubaté e Rama-Forte. Estes autores
obtiveram 84% de regeneração através da estaquia em posição vertical e 60% com
a posição horizontal.
A formação das mudas pela enxertia, sobre porta-enxertos obtidos de sementes,
ocasiona uma grande desuniformidade vegetativa nas mudas, que leva à formação
de pomares heterogêneos quanto ao porte e vigor das plantas. A solução para
este problema passa pelo estabelecimento de uma tecnologia de propagação
vegetativa de formação direta das mudas ou de porta-enxertos, o que
representará um significativo avanço na cultura do caquizeiro (Martins &
Pereira, 1989).
Pesquisas recentes com o caquizeiro no Brasil demonstraram que as técnicas de
cultura de tecidos in vitro apresentam resultados bastante promissores para a
clonagem da espécie (Biasi et al., 1999; Salomão et al., 1999; Salomão et al.,
2000). A clonagem poderá tornar-se viável após o melhor entendimento e controle
da morfogênese do caquizeiro.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de estudar o potencial
organogenético em caules e raízes do caquizeiro, visando a oferecer subsídios
para a definição futura de um protocolo de propagação vegetativa para esta
espécie.
MATERIAL E MÉTODOS
Os experimentos foram realizados com material juvenil, proveniente de sementes
retiradas de caquis do tipo variável, e material adulto coletado de plantas da
cultivar Fuyu, localizadas no pomar do Centro de Estações Experimentais do
Canguiri em Pinhais-PR. A pesquisa foi conduzida na área mencionada, no
Laboratório de Micropropagação e na câmara de nebulização do Departamento de
Fitotecnia e Fitossanitarismo da UFPR, em Curitiba-PR.
Diversos experimentos foram conduzidos a campo e em casa de vegetação,
utilizando as técnicas de estaquia, mergulhia e alporquia, em combinação com o
uso de AIB, anelamento e estiolamento.
Nos trabalhos de estaquia de caule, foram testados os seguintes fatores:
a)número de folhas (0, ½, 1, 1½ e 2 folhas) deixadas na estaca semilenhosa, com
15cm de comprimento, utilizando delineamento em blocos ao acaso, com 5
repetições e 10 estacas por parcela, totalizando 250 estacas; b)concentrações
de AIB (0; 1000; 2000 e 4000 mg.L-1) por imersão rápida (5 segundos) de estacas
com 2 folhas, utilizando o delineamento inteiramente casualizado, com 5
repetições e 10 estacas por parcela, totalizando 200 estacas; c)estiolamento
localizado, realizando o revestimento do caule ainda verde das brotações novas
em crescimento, de plantas a campo, com um pedaço de papel alumínio, com cerca
de 5cm de largura. Após 30 dias, os ramos estiolados foram cortados logo abaixo
da região revestida, e uma mesma quantidade de ramos não estiolados também foi
coletada. Antes da estaquia, metade dos ramos estiolados e não estiolados foram
tratados por imersão rápida em solução de 10.000 mg.L-1de AIB. O delineamento
foi em blocos ao acaso, com 5 repetições e 10 estacas por parcela, totalizando
200 estacas; d)estiolamento total, realizado com plantas adultas do caquizeiro
Fuyu, a campo, na fase de saída de dormência dos ramos, que foram revestidos
com sacos plásticos pretos e sacos de papel, para efeito do estiolamento total.
Assim que as brotações atingiram cerca de 10 cm de comprimento, a cobertura foi
retirada e as brotações foram coletadas. Antes da estaquia, todas as estacas
foram tratadas por imersão rápida em solução de AIB com a concentração de 3000
mg.L-1. O delineamento foi inteiramente casualizado, com 5 repetições e 10
estacas por parcela.
Todos os experimentos de estaquia de caule foram realizados em câmara de
nebulização intermitente, utilizando casca de arroz carbonizada como substrato.
O experimento com estaquia de raiz foi realizado com estacas retiradas de
plantas jovens de 2 anos de idade, provenientes de sementes. As raízes foram
coletadas no mês de julho, durante o período de dormência das plantas, e
cortadas em segmentos de 4 cm de comprimento. As raízes foram separadas em
quatro categorias, de acordo com o seu diâmetro: 2; 3; 4 e 5 mm. Também foram
testadas duas posições de estaquia: vertical e horizontal. O delineamento
experimental foi em blocos ao acaso, com 4 repetições e 10 estacas por parcela.
Os tratamentos foram arranjados em esquema fatorial 2x4, resultantes da
combinação dos fatores acima citados. O substrato utilizado foi a casca de
arroz carbonizada e a irrigação realizada apenas para manter o substrato úmido.
A avaliação foi realizada após 60 dias.
Os experimentos de mergulhia foram conduzidos a campo e em recipientes. O
experimento de mergulhia a campo foi realizado com mudas enxertadas da cultivar
Fuyu, utilizando a técnica da mergulhia contínua chinesa. As mudas, com um ano
de idade, foram plantadas com inclinação de 45º, num sulco aberto com cerca de
15 cm de profundidade, em julho de 1999. O plantio foi realizado em linha
dentro do sulco, uma planta após a outra, sendo utilizadas 30 mudas. Após a
brotação das gemas, que ocorreu no final do inverno, e o seu crescimento, as
mudas foram deitadas totalmente dentro do sulco e foi realizada uma amontoa com
terra na base das brotações para favorecer o enraizamento. O experimento foi
avaliado em junho de 2000, após 11 meses. O experimento de mergulhia em
recipientes foi realizado segundo a metodologia empregada por Biasi &
Koller (1993), utilizando também o estiolamento. Inicialmente, os caquizeiros
foram semeados em sacos plásticos, em julho de 1997. As plantas obtidas foram
enxertadas em julho de 1998 com garfos da cultivar Fuyu. Em janeiro de 1999, as
brotações foram podadas, deixando-se 5-6 gemas basais e, em seguida, as mudas
foram submetidas ao estiolamento total com cobertura de plástico preto. Após o
crescimento das brotações (cerca de 10 cm), estas receberam os seguintes
tratamentos: testemunha, anelamento mais AIB (2000 mg.L-1) e AIB (2000 mg.L-1)
aplicado com pasta de lanolina. Cada planta foi revestida com uma garrafa
plástica preenchida com terra mais casca de arroz carbonizada (2:1). O
delineamento foi em blocos ao acaso, com 5 repetições. O experimento foi
avaliado após 4 meses.
O experimento de alporquia foi instalado em novembro de 1998, em plantas
adultas, com os seguintes tratamentos: testemunha, anelamento (1cm), AIB e
anelamento mais AIB. O delineamento foi em blocos ao acaso, com 4 repetições e
10 alporques por parcela. Os alporques foram preparados na base de ramos em
crescimento da estação. O AIB foi aplicado na forma de pasta de lanolina na
concentração de 4.000 mg.L-1. O substrato utilizado foi a casca de arroz
carbonizada úmida, envolvida por filme de polietilieno transparente e amarradas
as extremidades com barbante. Em julho de 1999, o experimento foi avaliado. Com
as estacas resultantes, foi instalado outro experimento, tratando todas as
estacas com uma solução de AIB a 10.000 mg.L-1 por imersão rápida (5 segundos)
da base. As estacas foram separadas de acordo com os tratamentos originais e
colocadas em caixas com substrato Plantmax®, sendo avaliadas após 90 dias.
Os experimentos conduzidos in vitro foram realizados com plantas juvenis. O
primeiro experimento foi realizado com segmentos radiculares (4 cm) obtidos a
partir de embriões germinados in vitro,em meio MS½NO3. Neste experimento, foram
testadas as citocininas BAP, TDZ e cinetina, na concentração de 10 mM,
combinadas com AIA (ácido indolacético) (0,01 mM), exceto na testemunha, isenta
de reguladores. O delineamento utilizado foi inteiramente casualizado, com 4
repetições e 3 frascos por parcela. O experimento foi avaliado após 90 dias. As
brotações, com pelo menos uma folha expandida, obtidas neste experimento, foram
isoladas do explante inicial e utilizadas no segundo experimento, onde foi
testado o procedimento de enraizamento de brotações utilizado por BIASI et al.
(1993), que consistiu na permanência das brotações em meio de cultura com 25
mg.L-1 de AIB por 10 dias e posterior transferência para um meio com carvão
ativado, livre de reguladores de crescimento. A avaliação foi realizada após 60
dias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O número de folhas não afetou a capacidade de enraizamento das estacas
semilenhosas do caquizeiro 'Fuyu', pois todas as folhas caíram, e as estacas
morreram até o final do experimento. A presença de folhas nas estacas
proporciona um aumento do enraizamento em muitas espécies, como já demonstrado
para o abacateiro (Reuveni & Raviv, 1981), goiabeira (Pereira et al.,
1983), araçazeiro (Nachtigal et al., 1994), videira (Biasi et al., 1997) e
laranjeira (Roncatto et al., 1999). As folhas retidas nas estacas continuam o
processo fotossintético e as reações de síntese de carboidratos e outras
substâncias necessárias para a morfogênese das raízes adventícias (Hartmann et
al., 1990). O conteúdo de carboidratos dos ramos foi positivamente
correlacionado com a habilidade de enraizamento em plantas de difícil e fácil
enraizamento de Phoenix dactylifera (Reuveni & Adato, 1974). Entretanto, em
plantas de difícil enraizamento, como goiabeira serrana (Fachinello et al.,
1992), guabirobeira (Scutti, 1999), abacateiro (Barrientos-Priego et al., 1986)
e framboeseira cv. Admiral (Howard et al., 1987), apenas a presença de folhas
não é suficiente para estimular a organogênese em tecidos já diferenciados,
como ocorreu para o caquizeiro neste trabalho.
A utilização de AIB nas concentrações de 0 a 4000mg.L-1não apresentou efeito
sobre a emissão de raízes nas estacas semilenhosas do caquizeiro 'Fuyu'. Todas
as estacas morreram até a data da avaliação, sem apresentar brotação ou
formação de calo na base. Este resultado também foi observado em estacas
lenhosas e herbáceas do caquizeiro 'Giombo', que morreram sem apresentar
resposta à aplicação de AIB (Rubbo, 1989). As auxinas são conhecidas pelo seu
efeito indutor de raízes em estacas e freqüentemente consideradas como
limitantes do enraizamento, mas possuem pequeno ou nenhum efeito em espécies
lenhosas de difícil enraizamento (Wilson, 1994).
O estiolamento localizado não afetou a formação de raízes ou formação de calo,
sendo que todas as estacas estavam mortas na avaliação final. O estiolamento é
uma técnica que apresenta bons resultados no aumento da capacidade de
enraizamento em espécies de difícil enraizamento (Biasi & Koller, 1993;
Maynard & Bassuk, 1988), mas não foi verificado com o caquizeiro. Mesmo
combinando o estiolamento com a aplicação de 10.000 mg.L-1 de AIB não houve
resposta. Da mesma forma que no experimento anterior, o estiolamento total não
estimulou a formação de raízes nas estacas, que morreram até o final do
experimento. O estiolamento total apresenta, de forma geral, para as espécies
de difícil enraizamento, resultados melhores do que o estiolamento localizado
(Maynard & Bassuk, 1986). Entretanto, no caquizeiro, nem desta forma houve
enraizamento, o que demonstra um impedimento muito grande para a rizogênese,
que deve estar associado a fatores internos fisiológicos ainda não elucidados.
As estacas de raiz apresentaram resposta organogenética, ao contrário do
observado com os experimentos de estaquia de caule. Para as variáveis
porcentagem de estacas brotadas, comprimento das brotações e número de folhas
das brotações, não houve interação significativa entre os fatores estudados,
apenas de forma independente. A posição vertical apresentou-se superior em
todas as variáveis citadas, com mais de 50% de estacas brotadas e com brotos
maiores (Tabela_1). A polaridade no caquizeiro é bastante marcada, pois as
brotações apenas ocorreram na porção proximal das estacas, concordando com
Simão (1998). Quanto ao diâmetro das estacas, apenas houve diferença
significativa para a variável comprimento das brotações, onde as estacas com
maior diâmetro apresentaram maior comprimento. Entretanto, para as demais
variáveis (porcentagem de estacas brotadas e número de folhas), apesar de não
ocorrer significância estatística, houve uma tendência de superioridade nos
diâmetros maiores (Tabela_1).
Para a variável porcentagem de estacas enraizadas, houve interação
significativa. As estacas com os maiores diâmetros foram superiores às de 2 mm
na posição vertical. A posição vertical foi superior à horizontal em todos os
diâmetros, exceto com as menores de 2 mm, onde o enraizamento foi muito baixo
(Tabela_2). Estes resultados concordam com as observações de Boliani &
Sampaio (1988), que obtiveram maior enraizamento com estacas de caquizeiro na
posição vertical.
Na mergulhia a campo e em recipientes, não houve enraizamento. A utilização de
estiolamento em mudas com posterior mergulhia apresenta bons resultados para a
clonagem de espécies de difícil enraizamento, como o abacateiro (Biasi, 1995),
mas não apresentou nenhuma resposta para o caquizeiro.
Não houve enraizamento nos alporques realizados a campo. Apenas ocorreu a
formação de calos nos tratamentos com anelamento. Apesar de o processo de
alporquia ser considerado mais eficiente do que a estaquia, como em hibiscus
(Lucchesi, 1993), com o caquizeiro, isto não ocorreu. Os ramos coletados da
alporquia, que foram utilizados na seqüência para o experimento de estaquia,
também não enraizaram, e no momento da avaliação já se encontravam todos
mortos.
Ao contrário do observado a campo, no cultivo in vitro, foi obtida uma taxa de
66% de enraizamento das brotações, que apresentaram, em média, 4,7 raízes por
brotação. Este protocolo, já utilizado em abacateiro (Biasi et al., 1993),
mostrou-se eficiente para o enraizamento de brotações juvenis, necessitando ser
testado para explantes de tecidos adultos. Os tecidos juvenis respondem melhor
aos estímulos do que os tecidos adultos, sendo que a redução da capacidade de
enraizamento é uma das conseqüências do envelhecimento ontogenético (Assis
& Teixeira, 1998). Isto foi verificado por Salomão et al. (2000) para o
caquizeiro 'Cereja'. O enraizamento in vitro de brotações de caquizeiro já foi
obtido em diversas cultivares (Cooper & Cohen, 1984; Sarathchandra &
Burch, 1991; Tao & Sugiura, 1992).
No experimento de organogênese com segmentos de raízes, ficou novamente
evidente que os tecidos radiculares possuem uma competência maior do que os
caulinares para expressar o seu potencial morfogenético. Segundo Kerbauy
(1999), as respostas específicas de diferentes partes da planta são
determinadas pela competência das células-alvo, de tal forma que os hormônios,
por si sós, não controlam o padrão de diferenciação celular. Foi observada a
formação de uma massa de calo com grande quantidade de gemas nos explantes
tratados com a combinação de TDZ e AIA, não respondendo à presença de cinetina.
A conjugação BAP e AIA promoveu a formação de algumas brotações e, mesmo na
testemunha, houve a brotação e enraizamento de alguns explantes (Tabela_3). A
zeatina, na concentração de 10µM, combinada com AIA (0,01µM), mostrou-se
superior na indução de brotações em segmentos radiculares do caquizeiro 'Jiro'
in vitro(Tetsumura & Yukinaga, 1996).
CONCLUSÕES
1. Os tecidos radiculares do caquizeiro possuem maior competência morfogenética
do que os caulinares, respondendo de forma mais intensa aos estímulos para a
formação adventícia de novos órgãos.
2. Os métodos de propagação vegetativa via mergulhia, alporquia e estaquia
caulinar são ineficientes para o caquizeiro 'Fuyu'.
3. O cultivo de tecidos in vitro permite um maior controle e expressão do
potencial organogenético, sendo uma técnica promissora para a clonagem do
caquizeiro.
