DIVERGÊNCIA GENÉTICA ENTRE DOZE GENÓTIPOS DE ABACAXIZEIRO (Ananas comosus L,
Merril.) ESTIMADA POR ANÁLISE DE MARCADORES RAPD
INTRODUÇÃO
O Brasil tem uma expressiva participação na produção mundial de abacaxi,
estando entre os três primeiros produtores. A cultura ocupa aproximadamente
50000 ha, destacando-se o Estado de Minas Gerais, primeiro produtor, seguido
pelos Estados do Pará, Paraíba, Bahia, São Paulo e Espírito Santo (Agrianual,
2000). Em Minas Gerais, o Triângulo Mineiro é responsável por 92% da produção
do Estado (Couto, 1982).
O comércio mundial de abacaxi in naturaatingiu 700 mil toneladas, e o comércio
de abacaxi transformado em suco ou conserva é equivalente a 4 milhões de
toneladas de frutas frescas (Agrianual, 2000).
Na bibliografia, estudos moleculares sobre o abacaxizeiro,ganhou um valioso
espaço nos últimos anos. A bromelina, uma protease sulfídrica presente nesta
espécie, é, talvez, o enfoque científico mais estudado. Isto se dá pela
importância desta proteína na farmacologia, onde foi registrada sua
interferência no crescimento de células malignas, inibição de coágulos,
atividade fibrinolítica e ação antiinflamatória (Taussig & Batkin, 1998).
Estudos com marcadores moleculares ligados a doenças, pragas ou mesmo estudos
de divergência genética ainda são pouco encontrados na literatura sobre
abacaxi.
A técnica de RAPD, uma das derivações da PCR, trouxe uma melhoria acentuada à
técnica por utilizar iniciadores (primers) curtos e de seqüências arbitrárias
como um método de geração de marcadores moleculares polimórficos, não exigindo
assim o conhecimento prévio de seqüências do DNA a ser estudado (Welsh &
Mcclelland, 1990). Esta técnica abre uma nova perspectiva para a análise
genômica de indivíduos e populações (Chalmers et al., 1992; Howell et al.,
1994; Ferreira & Grattapaglia,1998;)
Vários trabalhos mostraram que a técnica RAPD foi eficiente na caracterização,
identificação, estudos de filogenia, análise genômica, identificação de
marcadores moleculares ligados a genes de interesse e estudos de composição
genômica (Stiles et al., 1993; Young & Kelly 1996; Fang et al., 1997; Hu et
al., 1997).
Ruas et al. (1995) citaram a importância das estimativas da relação e da
diversidade genética de cultivares de abacaxizeiro para avaliação de recursos
genéticos. Estes autores encontraram uma relação genética bastante similar
entre quatro cultivares de abacaxizeiro (Pérola, Smooth Cayenne, Primavera e
Perolera) e compatibilidade dos resultados obtidos por meio de marcadores
moleculares RAPD e análises das características morfológicas e agronômicas,
mostrando que a análise por RAPD pode ser usada de maneira eficiente para
caracterização de recursos genéticos no gênero Ananas.
Duval et al. (1999), por meio da utilização de enzimas de restrição, estudaram
o parentesco filogenético de uma coleção de 96 acessos de Ananas utilizando DNA
cloroplástico. Os resultados mostraram variações entre o gênero Ananas e
Pseudananas em regiões de cpDNA, sem, no entanto, sugerir uma nova divisão
dentro do gênero estudado.
Este trabalho teve como objetivo determinar a distância genética entre doze
cultivares de abacaxi por meio da técnica de RAPD.
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no Laboratório de Genética do Instituto de Genética
e Bioquímica da Universidade Federal de Uberlândia, no período de janeiro/1997
a fevereiro/1999.
Os abacaxizeiros utilizados neste experimento foram coletados no Brasil (Acre,
Maranhão, Piauí, Bahia, Minas Gerais) e Jamaica (Tabela_1). Os abacaxizeiros
provenientes do Acre foram coletados no banco de germoplasma da EMBRAPA/AC; os
do Maranhão, Bahia e Minas Gerais foram coletados em lavouras comerciais de
suas respectivas regiões e os do Piauí foram coletados numa pequena coleção do
CEFAS (Centro Educacional São Francisco de Assis). Todos os abacaxizeiros
obtidos foram plantados na área experimental da Universidade Federal de
Uberlândia.
Também foram coletadas duas outras espécies do mesmo gênero (A. ananassoides e
A. nanus) para serem avaliadas juntamente com os abacaxizeiros (A comosus).
Para extração de DNA, foi coletada uma folha jovem (a mais interna e
clorofilada da roseta) de cada indivíduo. Destas folhas, após serem bem lavadas
com detergente e água, foram utilizados 300 mg cortados em pequenos pedaços,
para se extrair o DNA.
O protocolo utilizado para extração foi o proposto por Ferreira &
Gratapaglia et al. (1998), com algumas modificações. Inicialmente, 300 mg de
folha fresca foram maceradas na presença de nitrogênio líquido e transferidas
para um tubo de 2 ml. Sobre cada extrato, foi adicionado 1,5 ml de tampão de
extração (Polivinilpirrolidone a 2%; NaCl 1,4M;Tris HCl pH 8,0 100mM; EDTA 20
mM; CTAB a 2%; b-Mercaptoetanol a 0,2%) e incubado em banho-maria a 65°C por
uma hora com posterior centrifugação a 11300g por 10 minutos. O sobrenadante
obtido foi transferido para um novo tubo e adicionado 4ml de RNAase (10 ng/ml),
incubando o extrato vegetal por 30 minutos a 37°C. Em seguida, completou-se o
volume do tubo com Clorofórmio:Álcool Isoamílico (24:1) e centrifugou-se por 10
minutos a 11300g. O sobrenadante foi coletado procedendo-se mais uma vez a
extração com Clorofórmio:Álcool Isoamílico. O DNA foi precipitado adicionando-
se ao sobrenadante 2/3 do volume de Isopropanol absoluto PA e 1/10 do volume de
Acetado de Sódio 3M. Após permanecer durante a noite a 4oC, os tubos foram
centrifugados a 11300g por 15 minutos e o DNA ("pellet") lavado com
etanol a 70%. Depois, o DNA foi seco em estufa a 37oC e ressuspendido em 100 ml
de Tris-EDTA (TE) ¾ DNA estoque.
De 119 primers testados, 11 foram selecionados para estudos de divergência
genética por serem mais informativos (Tabela_2). Todos os primers utilizados
foram fabricados pela OPERON Technologies Inc. sendo todos oligonucleotídeos
com 10 bases e de seqüências arbitrárias.
O volume total de cada reação foi de 20 ml. Cada reação continha Tris-HCl 10
mM, KCl 50mM, MgCl2 2mM, 400 mM de dNTPs (100 mM de dGTP, 100 mM de dCTP, 100
mM de dATP e 100 mM de dTTP), 8 pmoles de primer, 1,0 U de Taq DNA Polimerase,
15 ng de DNA genômico (ausente no controle negativo feito para cada bateria de
reações) e água ultrapura para completar o volume de 20 ml. Em cada reação, foi
adicionada uma gota de óleo mineral para evitar a evaporação. Antes de ir para
o termociclador, cada reação foi submetida a um pulso de 1810g.
Para cada bateria de reações, foi feito um controle negativo com todos os
compostos da reação exceto o DNA, para confirmar se os produtos amplificados
das reações representavam DNA genômico amplificado, contaminações ou artefatos
do primer.
As reações foram amplificadas em termociclador MJ Research, Inc., modelo PTC-
100, por 3 ciclos de 94°C/1 min, 35°C/1 min e 72°C/2 min; 34 ciclos de 94°C/
10s, 40°C/20s, 72°C/2 min, conforme descrito por Young & Kelly (1996).
Para cada primer, foram realizadas no mínimo duas reações para confirmar o
padrão de banda obtido, conforme descrito por Oliveira (1998).
Os produtos amplificados foram separados em gel de agarose 1,5% de 20cm x
24,5cm x 6mm em Tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X, de acordo com Sambrook et
al. (1989). A visualização dos produtos amplificados foi feita em luz
ultravioleta por meio do corante Brometo de Etídio, diluído no gel, numa
concentração aproximada de 0,5 mg/ml de gel.
Para a eletroforese, foram adicionados em cada amostra (15 ml) 3 ml de um
tampão de carregamento (Azul de bromofenol 3,61M, Xileno Cianol 4,64M, Sacarose
1,17M e EDTA 0,1M pH8,0). A eletroforese foi conduzida a 0,23 V/ml por 2 horas.
Os géis foram visualizados em transiluminador UV e fotografados em VDS Image
System ¾ Pharmacia, usando filtro laranja e com tempo de exposição 2,17
segundos, contraste de 0 a 6, e 0,45 de fator de correção da câmera.
Para análise dos dados, foi montada uma matriz binária de acordo com presença
(1) e ausência de (0) bandas reproduzíveis e mais intensas. A matriz gerada
pelo programa STATISTICA 4,5A (1993) foi usada para o cálculo das distâncias
genéticas e análise de agrupamento. As distâncias genéticas foram calculadas
pelo método de Porcentagem de Desacordo, que é dado pela fórmula: N'AB/NT, onde
N'AB é o número total de bandas polimórficas entre os genótipos comparados e
NTé o número total de bandas.
A análise de grupos ou "clusters" foi feita pelo método não ponderado
de agrupamento aos pares, utilizando médias aritméticas (UPGMA ¾
"Unweighted pair-group method using arithmetic average"), o qual
agrupa indivíduos de acordo com a similaridade. Sendo que os indivíduos mais
similares são agrupados inicialmente e assim, sucessivamente, até os indivíduos
ou grupos mais distantes.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para aumentar a eficiência na identificação de polimorfismo, os 11 primers
decâmeros utilizados foram selecionados de 119, de acordo com o maior número de
bandas geradas e a melhor definição dos produtos amplificados. Estes 11 primers
geraram 79 regiões polimórficas em 12 genótipos de abacaxizeiro. Estas bandas
apresentaram tamanhos estimados na faixa de 200 a 2700pb.
Para cada primer, foram realizadas duas ou mais repetições, sendo computadas
apenas as bandas que mostraram boa repetibilidade e intensidade. Estes cuidados
na montagem da matriz reduzem a possibilidade de eventuais erros na contagem
incorreta de produtos fracamente amplificados que não correspondam à verdadeira
história evolutiva da espécie (Lowe et al., 1996; Cabral, 1997; Oliveira,
1998).
A Figura_1 exemplifica um bom padrão de amplificação obtido nas repetições para
os doze genótipos analisados, como também mostra o tamanho-padrão dos
fragmentos amplificados pela técnica de RAPD que é de fragmentos entre 400 e
1500pb (Ferreira & Grattapaglia, 1998).
A Figura_2 mostra a análise de agrupamento baseada na Porcentagem de Desacordo
utilizando o método UPGMA. Ao nível de 40% de divergência, as espécies do
gênero Ananas foram separadas, conforme esperado, sendo A. anassoidese A. nanus
agrupadas, demonstrando entre os dois últimos um grau de semelhança maior do
que algumas variedades dentro de A. comosus. Ao nível de 31,1% de distância
genética, houve a definição de dois grupos para a população de A. comosus. O
grupo A, com distância genética variando de 6,7% a 28,9%, foi constituído de 7
genótipos, entre os quais o São Domingos, Pérola, RBR-1, Turiaçu, Smouth
Cayenne, Quinari e Jamaica. O grupo B, com a distância genética entre os
genótipos variando de 0% a 26,1%, ficou representado por 5 genótipos: Monte
Alegre-1, CEFAS, Floriano-1, Floriano-2 e Monte Alegre-2. Ananas anassoides e
A. nanus apresentaram-se como "outgroup". Estas duas espécies, apesar
de as suas características fenotípicas serem bastante similares ao A. comosus e
de se cruzarem com esta espécie (Kinjo, 1993), apresentaram uma distância
genética de 39,7% em relação ao abacaxizeiro comum. Os dados moleculares
confirmam a classificação taxonômica dessas espécies. No entanto, estudos com
RAPD com maior número de primers e estudos da viabilidade dos híbridos entre
estas espécies deveriam ser feitos para comprovar ou não a classificação
taxonômica atual (Oliveira, 1998; Skelton, 1996).
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Os genótipos CEFAS e Floriano-1 são molecularmente idênticos. Isto confirmou a
eficiência da técnica RAPD para estudos de distâncias genéticas, já que estes
genótipos são derivados de propagação vegetativa de um mesmo abacaxizeiro,
sendo assim clones (Ruas et al., 1995).
A proximidade entre os genótipos Pérola e São Domingos, bastante similares
fenotipicamente, e a divergência entre os genótipos Havaiano e Quinari, também
bastante similares fenotipicamente, mostraram a não-correlação entre a
caracterização fenotípica e a caracterização molecular.
CONCLUSÕES
1 - A uma distância genética de 31,1%, houve a separação dos genótipos de
Ananas comosus em dois grupos.
2 - Não foi encontrada divergência entre CEFAS e Floriano-2 com os 11 primers
testados, reforçando a hipótese de que estes materiais são originários de um
mesmo abacaxizeiro por meio de propagação vegetativa.
3 - Ananas anassoides e A. nanus divergiram de A. comosus a 39,7%.
4 - A técnica RAPD mostrou-se eficiente para o cálculo da divergência genética.
5 - Agrupamento por análise molécular nem sempre coincide com semelhanças
fenotípicas.
