ORGANOGÊNESE IN VITRO DE Citrus EM FUNÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE BAP E
SECCIONAMENTO DO EXPLANTE
ORGANOGÊNESE IN VITRO DE Citrus EM FUNÇÃO DE CONCENTRAÇÕES DE BAP E
SECCIONAMENTO DO EXPLANTE
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INTRODUÇÃO
A citricultura é uma atividade agrícola importante para o Brasil, sendo o
Estado de São Paulo o maior produtor de citros, representando 83% da produção
brasileira de laranja e 95% de suco para exportação. A laranja é o oitavo
produto de exportação do Brasil, responsável por 2,6% do total exportado. Em
1998, a laranja foi o primeiro produto de exportação do Estado de São Paulo e,
em 1999, foi o segundo (Fundecitrus, 2000). Mesmo diante desta importância da
citricultura, ainda existe a necessidade de encontrar alternativas para
solucionar alguns problemas inerentes à cultura, tais como o uso predominante
do limão-'Cravo' como porta-enxerto, obtenção de cultivares resistentes e/ou
tolerantes a determinados patógenos, bem como a obtenção de cultivares de
laranja precoces, visando à industrialização.
O melhoramento genético de citros apresenta-se como uma importante alternativa
em busca da solução dos problemas citados, embora ainda não tenha apresentado o
resultado esperado. Segundo Cristofani (1991), as limitações do melhoramento
genético convencional dos Citrus são um reflexo do comportamento genético e
reprodutivo deste gênero, influenciadas por fatores tais como, longo ciclo
reprodutivo, apomixia, alto grau de heterozigosidade e sementes
poliembriônicas.
A utilização de técnicas de cultura de tecidos constitui-se numa importante
ferramenta de auxílio ao melhoramento genético dos citros, pois apresenta
grande potencialidade e estratégias para estudos de fenômenos citológicos,
morfológicos e fisiológicos. Os trabalhos de cultura de tecidos em citros
tiveram grandes avanços a partir da última década, com o desenvolvimento de
protocolos de micropropagação (Starrantino & Russo, 1980), de cultura de
calos (Kochba et al., 1982) e células em suspensão (Cabasson et al., 1995), de
embriogênese somática (Kunitake, 1995), de organogênese (Peres-Molphe-Balch
& Ochoa-Alejo, 1997), de isolamento e cultivo de protoplastos (Grosser
& Gmitter Junior, 1990) e de obtenção de plantas transgênicas (Luth &
Moore, 1999).
A organogênese in vitro ocorre com a formação de gemas adventícias, que são
assim denominadas por terem origem em locais diferentes daqueles onde se formam
no curso normal de desenvolvimento da planta. Esta via de regeneração pode ser
indireta ou direta, dependendo da formação ou não de calos, respectivamente. O
sucesso para qualquer via de regeneração in vitro depende de vários fatores,
onde os fitorreguladores se destacam como os principais controladores da
morfogênese in vitro. Dentre as citocininas, o BAP tem sido muito eficaz para
promover a multiplicação em diversas espécies e parece ser a citocinina mais
adequada para a multiplicação de parte aérea e indução de gemas adventícias
(Grattaplagia & Machado, 1998). Diversos trabalhos em frutíferas corroboram
com esta afirmação, como os de Peres-Molphe-Balch & Ochoa-Alejo (1997) em
citros, Almeida et al. (1998) em abacaxizeiro, Vesco & Guerra (1999) em
goiabeira, Schwartz et al. (2000) em maciera, dentre outros. Além disso, em
algumas culturas, como os citros, as brotações obtidas na fase de multiplicação
geralmente são pequenas e não se encontram em condições de ser individualizadas
para o enraizamento. Neste caso, necessita-se de uma fase de alongamento e as
giberelinas são os principais reguladores vegetais utilizados com esta
finalidade (Grattaplagia & Machado, 1998). Posteriormente, o enraizamento
das brotações é fundamental para a obtenção de plantas aclimatizadas e em
condições de serem transferidas para campo. Segundo Assis & Teixeira
(1998), as auxinas são as principais responsáveis pela rizogênese, sendo o ANA
e AIB as mais utilizadas, principalmente em plantas lenhosas.
O objetivo deste trabalho foi conduzir experimentos visando a avaliar a
resposta organogenética in vitro em função da utilização do BAP para as
variedades cítricas limão-'Cravo' e laranja-'Pêra', bem como a influência do
seccionamento dos explantes para a variedade laranja-'Valência'.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Biotecnologia de Plantas Hortícolas
do Departamento de Produção Vegetal da Escola Superior de Agricultura
"Luiz de Queiroz" (ESALQ), da Universidade de São Paulo (USP). Foram
realizados três experimentos entre as variedades limão-'Cravo' (Citrus limonia
(L.) Osbeck) e laranjas-'Pêra' e 'Valência' (Citrus sinensis (L.) Osbeck). Para
as três variedades, as sementes foram retiradas dos frutos e receberam a
primeira lavagem para a eliminação da mucilagem. Em câmara de fluxo laminar, a
desinfestação foi realizada em solução de hipoclorito de sódio (2,5%) e água
(2:1), durante 20 minutos, e incubadas em tubos de ensaio contendo 15 mL do
meio de cultura MT (Murashige & Tucker, 1969), acrescido de 25 g.L-1de
sacarose para favorecer a germinação.
Experimento 1: Efeito do BAP na organogênese in vitro de limão-'Cravo'
Os tubos de ensaio contendo as sementes foram colocados em câmara de
crescimento com fotoperíodo de 16 h, temperatura de 27 ± 2ºC e intensidade
luminosa de 1500 lux, durante 60 dias. Após este período, foram utilizados como
explantes, segmentos internodais das plântulas germinadas. O cultivo dos
explantes foi realizado em placa de Petri contendo 20 mL do meio MT, acrescido
de 25 g.L-1 de sacarose e variando-se as concentrações de BAP em 0; 2,5; 5; 7,5
e 10 mg.L-1. As placas foram mantidas em câmara de crescimento, nas mesmas
condições citadas anteriormente, por 60 dias. Posteriormente, as brotações
obtidas foram cultivadas em meio de alongamento (MT + 25 g.L-1 de sacarose + 1
mg.L-1 de ácido giberélico-GA3), durante 60 dias. Em seguida, estas brotações
foram transferidas para meio de enraizamento (MT + 25 g.L-1 de sacarose + 0,5
mg.L-1 de carvão ativado + 1 mg.L-1 de ácido naftalenoacético-ANA), durante 60
dias. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com cinco
tratamentos e oito repetições, sendo cada parcela constituída por oito
segmentos internodais. Os parâmetros avaliados foram o percentual de explantes
responsivos e o número de brotações por explante.
Experimento 2: Efeito do BAP na organogênese in vitrode laranjeira-'Pêra'
Os tubos de ensaio contendo as sementes foram colocados no escuro durante três
semanas, para favorecer o estiolamento do epicótilo, e; posteriormente, em
condições de fotoperíodo de 16 h, por uma semana. Após este período, foram
utilizados como explantes, segmentos de epicótilo com aproximadamente 1 cm de
comprimento e cultivados em placa de Petri contendo 20 mL do meio MT, acrescido
de 25 g.L-1 de sacarose e variando-se as concentrações de BAP em 0; 1; 2; 3 e 4
mg.L-1. As placas foram mantidas em câmara de crescimento, nas mesmas condições
citadas no experimento anterior, bem como o alongamento e o enraizamento das
brotações. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com
cinco tratamentos e cinco repetições, sendo cada parcela constituída por oito
segmentos de epicótilo. Os parâmetros avaliados foram o percentual de explantes
responsivos e o número de brotações por explantes.
Experimento 3: Efeito do seccionamento do explante na organogênese in vitro de
laranja-'Valência'.
Os tubos de ensaio contendo as sementes foram colocados nas mesmas condições do
experimento 2. Também foram utilizados segmentos de epicótilo como explantes.
Neste caso, os explantes foram cultivados em placa de Petri contendo 20 mL do
meio MT acrescido de 25 g.L-1 de sacarose e 1 mg.L-1 de BAP. Parte destes
explantes foram seccionados longitudinalmente e a face cortada foi colocada em
contato com o meio de cultura. As condições de cultivo foram idênticas aos
experimentos anteriores, bem como os meios de alongamento e enraizamento das
brotações. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com dois
tratamentos e dez repetições, sendo cada parcela constituída por oito
explantes. O parâmetro avaliado foi o número médio de brotações por explante.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Efeito do BAP na organogênese in vitro de limão-'Cravo'
Verificou-se que a concentração 2,5 mg.L-1 de BAP foi aquela que promoveu o
maior percentual de explantes responsivos (62,5%), embora não diferindo
significativamente da concentração 5 mg.L-1. Observou-se, ainda, que as maiores
concentrações (7,5 e 10 mg.L-1) exerceram efeito antagônico sobre o percentual
de explantes com brotações (Figura_1). Provavelmente, estes níveis exógenos de
BAP, interagindo com o nível endógeno de citocinina, causaram efeito
fitotóxico, suprimindo as brotações. Esses resultados foram semelhantes aos
obtidos por Pasqual & Ando (1989a), no cultivo in vitrode gemas axilares de
plântulas dePoncirus trifoliata, onde elevadas concentrações de BAP promoveram
redução no percentual de explantes com brotações, sendo que a concentração
ótima de BAP foi de 1 mg.L-1, que é inferior à obtida neste trabalho (2,5 mg.L-
1). Isto deve-se, provavelmente, ao potencial morfogenético inerente a cada
variedade.
Com relação ao número de brotações por explantes, a concentração 2,5 mg.L-
1 também foi aquela que promoveu o maior número (2 brotações/explante), não
diferindo significativamente da concentração 5 mg.L-1, com média de 1,4
brotação/explante (Tabela_1). Já Peres-Molphe-Balch & Ochoa-Alejo (1997)
obtiveram média de 3 novos brotos por segmento internodal de lima ácida
'Galego' cultivada in vitro, na concentração de 7,5 mg.L-1 de BAP. Essa
concentração pode ser considerada elevada, quando se compara ao resultado deste
trabalho, onde a concentração ótima estimada foi 3,71 mg.L-1 de BAP, a partir
da qual o número médio de brotações por explante decresceu (Figura_2). Neste
experimento, não se pode afirmar que o efeito do BAP foi primário, determinando
a rota que seguiram as células, ou, pelo contrário, se as células estavam
predeterminadas para seguir esta rota e esse regulador vegetal apenas ativou a
expressão das mesmas. Todavia, verificou-se a importância dessa citocinina na
organogênese in vitro do limão-'Cravo', como se evidencia na Figura_3 . Vale
ressaltar que as brotações alongaram satisfatoriamente e atingiram índice de
80% de enraizamento. Grosser & Gmitter Júnior (1990) também obtiveram
alongamento satisfatório em plântulas de híbridos somáticos de citros,
utilizando 1 mg.L-1 de GA3 no meio de cultura. Já com relação ao enraizamento,
a utilização do ANA, em concentrações variando de 0,5 a 5 mg.L-1, também foi
fundamental para enraizar brotos de laranja-doce 'Pineapple', com índice de 85%
(Duran-Vila et al., 1989); de lima ácida 'Galego', com 70% (Peres-Molhe-Balch
& Ochoa-Alejo, 1997) e citrange 'Troyer', com 86% (Moreira-Dias et al.,
2000).
Efeito do BAP na organogênese in vitro de laranja-'Pêra'
Os resultados apresentados na Figura_4 demonstraram que as concentrações 0; 1 e
2 mg.L-1 de BAP proporcionaram 95; 85 e 65% de explantes responsivos,
respectivamente, não diferindo significativamente entre si. Observou-se que, na
ausência de BAP, houve o maior percentual de explantes com brotações. Este
resultado indica que, provavelmente, o nível endógeno de citocinina foi
suficiente para assegurar esta resposta, em virtude de o explante utilizado
(segmento de epicótilo) ser oriundo de plântulas germinadas in vitro, que
apresentavam sistema radicular já formado e, segundo Burch & McGaw (1993),
os meristemas das raízes são os principais responsáveis pela síntese de
citocinina. Já as concentrações 3 e 4 mg.L-1 de BAP conduziram à redução do
percentual de explantes responsivos. Diversos trabalhos como os de Peres-
Molphe-Balch & Ochoa-Alejo (1997), em lima ácida 'Galego', Otoni &
Teixeira (1991) em laranja-'Pêra' e Pasqual & Ando (1989b) em laranja-
'Valência', têm demonstrado que elevadas concentrações de BAP apresentam efeito
inibitório no percentual de explantes responsivos.
Quanto ao número médio de brotações por explante, verificou-se que as
concentrações 1 e 2 mg.L-1 foram aquelas que apresentaram o melhor resultado,
com 2,53 e 2,62, respectivamente, não diferindo significativamente entre si
(Tabela_2). A concentração ótima estimada neste experimento foi 0,95 mg.L-1 de
BAP, a partir da qual houve decréscimo para o número de brotos/explante (Figura
5). Já Otoni & Teixeira (1991), no cultivo in vitro da laranja-'Pêra',
conseguiram melhor resultado na concentração de 0,75 mg.L-1 de BAP, com média
de 3,5 brotações. Entretanto, estes autores utilizaram segmentos nodais de
plantas juvenis como explante, o que pode explicar essa diferença de resposta.
As brotações obtidas neste experimento também alongaram de forma satisfatória e
atingiram índice de 75% de enraizamento. Ghorbel et al. (1998), utilizando ANA
a 3 mg.L-1 no meio de enraizamento, conseguiram índice de 84% para brotos de
Citrus macrophylla; no entanto, não obtiveram enraizamento para os brotos de
Citrus paradisi e Citrus aurantium, concluindo que a rizogênese é genótipo-
dependente.
Efeito do seccionamento do explante na organogênese in vitro de Laranja-
'Valência'
Os resultados demonstraram que houve diferença significativa entre os
tratamentos, onde os explantes seccionados proporcionaram média de 2,94
brotações e aqueles não seccionados apresentaram média de 1,6 brotação (Figura
6). Segundo Cutter (1986), o seccionamento em regiões próximas a meristemas e
parênquimas estimula a divisão celular. Assim, é provável que o seccionamento
realizado neste trabalho, combinado com a aplicação exógena de citocinina
(BAP), tenha estimulado maior divisão celular e, conseqüentemente, maior
diferenciação de gemas adventícias, conduzindo ao maior número de brotações,
quando comparado com os explantes não seccionados. Entretanto, as brotações
oriundas dos explantes seccionados apresentaram-se pouco desenvolvidas,
provavelmente devido à maior competição nutricional no meio de cultura e à
menor reserva endógena do explante seccionado. Este fato, possivelmente,
contribuiu para o alongamento insatisfatório das brotações e índice de
enraizamento de apenas 45%, enquanto naquelas oriundas dos explantes não
seccionados, este índice alcançou 80%.
CONCLUSÕES
De acordo com experimentos realizados neste trabalho, pode-se concluir que:
1 - A concentração 2,5 mg.L-1 de BAP foi aquela que melhor favoreceu a
organogênese in vitro em segmentos internodais de limão-'Cravo', tanto para o
percentual de explantes responsivos, como para o número de brotações
adventícias.
2 - A concentração 1 e 2 mg.L-1 de BAP foram aquelas que melhor favoreceram a
organogênese in vitro em segmentos de epicótilo da laranja-'Pêra',
principalmente para o número de brotações adventícias.
3 - O alongamento das brotações nas variedades limão-'Cravo' e laranja-'Pêra'
foi satisfatório, e as mesmas atingiram 80% e 75% de enraizamento,
respectivamente.
4 - O seccionamento dos segmentos de epicótilo favoreceu a organogênese in
vitro da laranja-'Valência', quando comparado com aqueles não-seccionados,
porém as brotações adventícias obtidas apresentaram alongamento insatisfatório
e menor índice de enraizamento.
