Efeitos da remobilização por meio de exercício físico sobre a densidade óssea
de ratos adultos e idosos
INTRODUÇÃO
O tratamento de fraturas ósseas, bem como doenças degenerativas ou articulares,
pode exigir cirurgia ou tratamento conservador com subsequente imobilização dos
membros (Konno et al., 2008). Entretanto, longos períodos de imobilização
conduzem à perda óssea e de propriedades do osso (Bertolini, Oliveira &
Cararo, 2010).
O tecido ósseo é constituído por um tecido conjuntivo especial, diferindo de
outros materiais estruturais pelo fato de ser autorreparador, podendo alterar
suas propriedades e geometria em resposta às mudanças na demanda mecânica
(Turner, 2000). A falta de sustentação de peso e de atividade física levam à
diminuição no estímulo mecânico necessário para crescimento e remodelamento
ósseo, que pode resultar na ocorrência da osteoporose e possibilitar fraturas
(Esteves et al., 2010).
Com relação ao envelhecimento sabe-se que é caracterizado por uma diminuição
funcional dos tecidos, órgãos e sistemas do organismo, com redução da
capacidade de adaptação a estímulos internos e externos (Figueiredo, Ferreira,
Appell & Duarte, 2008). Devido à maturação e envelhecimento do tecido
ósseo, muitas mudanças podem ser observadas como a diminuição da deformação
plástica e o acúmulo de microdanos, o que tem um efeito na propriedade do
tecido ósseo e no risco de fratura (Burr, 2002). Além disso, as alterações
provocadas pelo processo de senescência sobre estes tecidos podem resultar em
maior suscetibilidade a lesões, sendo assim, a eleição do protocolo de
reabilitação deve ser cautelosa. Nesse sentido, a adequação de um método de
tratamento que possa ser efetivo no tecido ósseo é de suma importância no
período pós-clinico.
A utilização do exercício físico pode ser um meio efetivo no aumento da massa
óssea e assim minimizar os efeitos deletérios da imobilização. Dessa forma, a
presente pesquisa visou estudar os efeitos da imobilização e remobilização
sobre o tecido ósseo de ratos adultos e idosos.
MÉTODO
Amostra
Foram utilizados 80 ratos machos da linhagem Wistar (Rattus novergicus,
variedade albina, Rodentia, Mammalia), provenientes do Biotério Central da
UNESP, Campus de Botucatu, e alocados no Biotério da FCT/UNESP (Campus de
Presidente Prudente) mantidos durante todo o experimento, dispostos em gaiolas
plásticas coletivas de dimensão 30 × 16 × 19 cm contendo, no máximo, 5 animais
em cada. Foram mantidos sob temperatura média de 22 ± 2°C, humidade relativa a
60%, ciclo claro/escuro de 12 horas, com início do ciclo claro às 7:00 horas,
alimentação padrão para roedores e água fornecidas ad libitum. Os animais foram
divididos em 8 grupos em função das variáveis independentes (Tabela_1).
Os procedimentos adotados foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade de Ciências e Tecnologia de Presidente Prudente sob o protocolo nº
312/2008, seguindo os princípios éticos na experimentação animal (COBEA).
Devido a modificações no projeto original e na instituição do Comitê de Ética
no Uso de Animais (CEUA) da Faculdade de Ciências e Tecnologia de Presidente
Prudente no ano de 2010, este projeto foi reencaminhado e aprovado (protocolo
nº 05/2010).
Instrumentos e Procedimentos
Protocolo de Imobilização
Para a imobilização, os animais foram anestesiados pela injeção da associação
de dois anestésicos, cloridrato de ketamina (80 mg/kg) e cloridrato de xilazina
(15 mg/kg), via intraperitoneal (Matheus, Gomide, Oliveira, Volpon &
Shimano, 2007). Confirmada a anestesia, eles tiveram os tornozelos envolvidos
por uma malha tubular, sendo em seguida utilizada uma atadura gessada de
secagem rápida com aproximadamente três centímetros de largura, aplicada de
maneira convencional para a imobilização dos membros posteriores, desde a pelve
até o tornozelo (Figura_1). O gesso foi substituído quando necessário,
respeitando o mesmo procedimento.
A imobilização foi realizada bilateralmente, com ambos os membros posteriores
(pelve, quadril e joelho) em extensão e o tornozelo em flexão plantar, a fim de
manter o músculo gastrocnémio em posição de encurtamento.
Os animais permaneceram imobilizados por sete dias consecutivos, mantidos em
gaiolas individuais com livre acesso à água e ração. Anteriormente à aplicação
da técnica de imobilização gessada os animais dos grupos G4 e G8, foram
submetidos a um processo de adaptação ao meio líquido durante 15 minutos por 10
dias consecutivos (Figura_1), a fim de reduzir o estresse do animal sem,
entretanto, promover adaptações fisiológicas decorrentes do exercício físico
(Camargo Filho et al, 2006; Manchado, Gobatto, Cortarteze, Papoti, & Mello,
2006).
Após a retirada da imobilização, os animais dos grupos G3 e G6 foram mantidos
em gaiolas coletivas para remobilização livre, permanecendo no biotério por
período de sete dias, sendo posteriormente eutanasiados. Os animais dos grupos
G4 e G8 também foram submetidos ao mesmo procedimento, porém por período de
dois dias, antes da aplicação do protocolo de exercício físico.
Protocolo de exercício
Utilizou-se um tanque (Figura_1) contendo 8 tubos cilíndricos com 25 cm de
diâmetro e 100 cm de profundidade, contendo no máximo 70 cm de água a 31 ± 1°C,
de modo que os animais não conseguiram apoiar a extremidade da cauda no fundo
do tanque (Manchado et al., 2006).
Após dois dias de remobilização livre, os animais dos subgrupos G4 e G8 foram
submetidos a cinco sessões (diárias) individuais de natação com duração de 25
minutos nas mesmas condições da adaptação sem adição de carga nos animais.
Coleta e preparo do material
Os animais foram submetidos à eutanásia por meio de superdosagem da associação
de cloridrato de ketamina e cloridrato de xilazina via intraperitoneal,
seguindo os princípios éticos em pesquisa animal.
Após a eutanásia, a tíbia direita foi retirada por meio de incisão longitudinal
com remoção da pele e de partes moles, deixando o osso sem revestimento dos
tecidos à temperatura de -20° C para posterior realização da análise da
densitometria óssea e ensaio mecânico de flexão em três pontos.
Densitometria óssea
As tíbias armazenadas foram submetidas à análise de densitometria em aparelho
densitómetro de dupla emissão de raios-X (DXA), modelo DPX-Alpha, Lunar
Corporation®, Madison,Wis, pertencente à Faculdade de Odontologia de Araçatuba
– UNESP, utilizando-se um software especial desenvolvido para pequenos animais
(Apolinário, Coelho & Louzada, 2011).
Os ossos foram submersos num recipiente de plástico contendo 2 cm de
profundidade de água para simular tecido mole (in vivo). O terço médio da tíbia
foi delimitado pelo aparelho, sendo essa área percorrida pelo DXA (5 cm × 4
cm). O laser do densitómetro foi ajustado acima do centro do osso onde se
iniciou a captura da imagem.
Após a captura das imagens os ossos foram analisados utilizando-se a ferramenta
de análise manual. A área desejada para análise foi delimitada na região do
terço médio da diáfise da tíbia e esta foi contornada para obtenção dos valores
de conteúdo mineral ósseo e densidade mineral óssea.
Ensaio mecânico
O ensaio mecânico de flexão a três pontos em cada tíbia foi realizado por meio
de uma máquina universal de ensaios mecânicos EMIC® 2000, que pertence ao
Departamento de Física, Química e Biologia da Faculdade de Ciências e
Tecnologia de Presidente Prudente – FCT/UNESP, dotada de célula de carga de 50
kgf ajustada para a escala de 20 kgf.
O dispositivo para ensaio de flexão a três pontos é constituído por dois apoios
com perfil circular de 3.5 mm de diâmetro situados na base da máquina e
equidistantes 20 mm e um atuador ou cutelo posicionado entre os apoios, com a
mesma forma e dimensão dos apoios, acoplado à parte móvel da máquina de ensaio
por meio de célula de carga. A tíbia foi posicionada de forma que o ponto de
referência medido ficasse alinhado com o atuador, com velocidade de descida de
5 milímetros/minuto (Figura_2).
O osso foi ajustado de tal forma a não se deslocar durante o ensaio, tendo uma
pré-carga inicial nula. O ensaio prosseguiu, sendo que as cargas aplicadas
foram monitoradas até o momento onde houve a rutura do tecido ósseo. A partir
de então foram obtidos valores de força máxima e deformação. Os parâmetros
analisados foram força e tensão máxima necessária para provocar a deflexão ou
deformação medida na região do atuador e provocar a fratura óssea (Léo, Cunha,
Oliveira & Prado, 2012).
Análise Estatística
Para análise estatística foram feitos cálculos de média e desvio padrão. Foi
utilizado o teste de normalidade de Shapiro-Wilk para verificar a presença ou
ausência de distribuição Gaussiana. Após a constatação da distribuição normal
dos dados, foram usadas as análises paramétricas. Para verificação de
diferenças entre as variáveis dos diferentes grupos, foi utilizada a análise de
variância (ANOVA one way) com o teste post hoc de Tukey. Para todas as
análises, o nível de significância adotado foi de 5% (p< 0.05).
RESULTADOS
A mensuração da massa óssea foi realizada logo após a coleta do material. Esses
dados permitem a verificação das alterações da massa óssea após o período de
aplicação dos protocolos de imobilização e de remobilização nos grupos adultos
G2, G3 e G4 e idosos G6, G7 e G8 (Figura_3).
Foi observado um aumento na massa óssea dos animais adultos submetidos ao
protocolo de remobilização, tanto livre (G3), quanto por meio de exercício
físico (G4). Esse aumento elevou a massa óssea para valores acima do grupo
controle. Porém nos animais idosos o aumento da massa óssea só ocorreu até os
níveis observados nos animais do grupo controle.
Os valores observados a partir das análises da densidade mineral óssea
demonstram que os animais remobilizados, apresentaram valores próximos do grupo
controle, evidenciando que houve uma recuperação da densidade mineral óssea
após a imobilização (Tabela_2). Nota-se diferença estatisticamente significante
na F-Max entre os grupos adultos imobilizados (G2) e remobilizados livre (G3).
Nos grupos idosos foi verificada diferença significante entre os grupos
controle (G5), imobilizados (G6), remobilizados livre (G7) quando comparados ao
grupo remobilizado por meio de exercício físico (G8).
DISCUSSÃO
O presente estudo verificou os efeitos da imobilização e remobilização por meio
do exercício físico (natação) no tecido ósseo. Sendo avaliados estes efeitos
por meio da mensuração da massa óssea, densitometria óssea e ensaio mecânico.
Foi observado que houve aumento da massa óssea e das propriedades mecânicas
ósseas favorável aos grupos submetidos ao exercício físico, demonstrando que
este tipo de atividade tem capacidade de promover o aumento da resistência
óssea.
Estudos mostram que a atividade física de baixa e moderada intensidade tem a
capacidade de promover alterações no tecido ósseo, melhorando seus componentes,
mesmo se executada por um curto período de tempo. Contudo, também é comprovado
que a inatividade pode levar a uma perda relativa de massa óssea (Apolinário et
al., 2011).
Foi possível observar no osso a diminuição de suas propriedades mecânicas nos
animais submetidos ao processo de imobilização, tendo perdas significativas de
sua deformação óssea, se comparados com o grupo remobilizado livre. A
imobilização afeta diretamente os propriedades mecânicas que levam à síntese
óssea. A ausência de estímulos sobre o tecido ósseo resulta na diminuição da
deposição de cálcio, tornando-o mais frágil e enfraquecido. Portanto, o
estímulo de sobrecarga é necessário para regular a resposta óssea local e,
deste modo, proporcionar uma melhor calcificação do tecido, crescimento e
remodelamento (Vasconcelos & Santos-Júnior, 2010).
A perda de massa óssea torna o osso mais suscetível à fratura. Nesse sentido,
todo tecido biológico tem necessidade de receber estímulos para promover
adaptações e desenvolver-se, especialmente o osso, que é remodelado ao longo de
toda a vida e tem a necessidade de estímulos mecânicos para favorecer seu
desenvolvimento (Villafañe, Cleland & Fernández-de-las-Peñas, 2013).
Após a análise da densidade mineral óssea, foi verificado que não houve
diferença entre os grupos de animais adultos e idosos. Tal fato pode ser
justificado pelo curto período de imobilização, o qual foi insuficiente para
promover perdas significativas. Estudos com maior período de imobilização são
necessários para que haja uma diminuição significante do conteúdo mineral ósseo
e consequentemente avaliar a influência do exercício de natação na recuperação
tecidual.
O equilíbrio entre a reabsorção e a formação de tecido ósseo é influenciado por
diversos fatores, como nutrição, atividade hormonal, atividade física e outros
(Hojan, Milecki & Leszcznski, 2013). O impacto mecânico quando diminuído
pelo desuso causado por condições sistémicas ou locais, como a imobilização,
leva a um processo de adaptação com aumento da reabsorção e consequente
enfraquecimento do tecido ósseo durante períodos mais longos, podendo
caracterizar-se uma osteopenia (Apolinário et al., 2011). Nesse caso, o osso,
assim como todos os outros tecidos, é adaptativo a condições impostas, e
desenvolve sua estrutura e função por meio de forças mecânicas e demandas
metabólicas. A deposição do cálcio é parcialmente regulada pela quantidade de
carga que lhe foi imposta. Assim, quanto maior forem as forças aplicadas, maior
a ativação dos osteoblastos, tornando-os mais resistentes (Esteves et al.,
2010).
Ramos et al. (2012) observaram que ratos submetidos ao exercício de natação não
apresentaram um aumento significativo das propriedades mecânicas. Porém, no
estudo de Huang et al. (2010) foi verificado um comportamento das propriedades
mecânicas semelhante às utilizadas no presente estudo, com alterações
ocasionadas pela natação de baixa intensidade.
A natação é questionada por ser um modelo de exercício que não gera impacto e
consequentemente não resulta em grandes alterações no tecido ósseo,
inviabilizando muitas vezes o tratamento de doenças ósseas. No entanto, no
presente estudo foi observado que apesar de não haver o aumento da massa,
também não ocorreu a diminuição da mesma. Além disso, a deformação nos animais
idosos apresentou melhora significante (Kemper et al., 2009).
O presente estudo se limitou a investigar o efeito da remobilização por meio da
natação como fator de recuperação de tecido ósseo. Sugere-se que sejam
utilizados modelos diferentes de atividade física, como corrida em esteira
rolante ou saltos com sobrecarga, que possam promover efeitos diferenciados dos
expostos na presente pesquisa. Além disso, a utilização da suplementação
alimentar pode vir a contribuir com a literatura, no sentido de induzir ao
aumento das propriedades mecânicas do tecido ósseo e na sua densidade.
CONCLUSÕES
A imobilização resultou na diminuição da força máxima no grupo adulto. Nos
animais idosos a imobilização promoveu redução na deformação óssea. Além disso,
o exercício foi capaz de restaurá-la, podendo assim ser utilizado como meio
terapêutico na manutenção da massa óssea.
