Estudo morfoquantitativo da parede da aorta de ratos wistar idosos treinados
com exercício aeróbio
O envelhecimento é um processo fisiológico relacionado com alterações no
sistema cardiovascular, sendo considerado um dos fatores de risco para o
desenvolvimento de várias doenças como a aterosclerose (Girerd & Mourad,
2007; Yildiz, 2007). Segundo Yildiz (2007), as alterações cardiovasculares
advindas do envelhecimento são as maiores causadoras de mortalidade no mundo.
Dentre os mecanismos envolvidos na aterosclerose estão às alterações
endoteliais promovidas pelas dislipidemias, hipercoagulação, oferta
insuficiente de óxido nítrico (ON), estresse oxidativo, inflamação e disfunção
endotelial. Estas alterações na artéria podem ser caracterizadas pelo aumento
da espessura (δ) das túnicas, devido à destruição gradual das fibras elásticas
e pelo aumento do depósito de substâncias como o cálcio na matriz extracelular
(MEC) (Girerd & Mourad, 2007).
O sedentarismo está relacionado ao desenvolvimento de doenças (Kannel, 1967) e
a prática de exercícios tem a capacidade de prevenir ou retardar o
desenvolvimento de placas de ateroma nas artérias (Kramsch, Aspen, Abramowitz,
Kremendahl, & Hood Jr., 1981). O limiar anaeróbio (Lan) é um parâmetro de
aptidão aeróbia, sendo definido como a intensidade do exercício a partir da
qual ocorre aumento exponencial na concentração de lactato sanguíneo [lac]
(Svedahl & Maclntosh, 2003). Diversos métodos têm sido utilizados para
identificar o Lan, como o limiar ventilatório (Wasserman, Whipp, Koyal, &
Beaver, 1973), o limiar glicêmico (Simões, Campbell, Kushnick, Nakamura,
Katsanos, & Baldissera, 2003) e o limiar de lactato (LL) (Svedahl &
Maclntosh, 2003).
A utilização do exercício em intensidade do LL tornou-se vantajosa por
determinar a capacidade aeróbia sem que seja necessário atingir o consumo
máximo de oxigênio, diminuindo-se assim os riscos cardiovasculares (Wasserman,
2002). A resposta do [lac] ao exercício tem sido considerada válida para
diagnóstico da aptidão aeróbia, prescrição e treinamento em humanos (Svedahl
& Maclntosh, 2003) e ratos (Cunha, Cunha, Segundo, Pacheco, Moreira, &
Simões, 2008).
Gobatto et al. (2001) e Voltarelli, Gobatto, & Mello (2002) foram os
primeiros a publicarem estudos com aplicação de protocolos para determinação do
máximo estado estável de lactato (MEEL) e LL em ratos na natação. Sabendo que
os princípios gerais que regulam o fluxo de lactato são válidos para ambas as
espécies e que é possível identificar o LL em ratos (Cunha et al., 2009), assim
como também é possível identificar a MEEL, que acontece por volta de 5.5
mmol.L-1 de lactato nos ratos (Cunha et al., 2009; Gobatto et al., 2001) e nos
humanos ocorre por volta de 4 mmol.L-1. Pode-se sugerir que a cinética de
lactato seja semelhante entre humanos e ratos, e a utilização destes métodos
para avaliação e prescrição de treinamento torna-se muito importante na
pesquisa.
Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do
treinamento de natação na intensidade do limiar anaeróbio sobre os componentes
da parede da aorta em ratos Wistar idosos.
MÉTODO
Amostra
Foram utilizados 10 ratos Wistar, machos, idosos (478 dias de vida) e
sedentários, com peso corporal (PC) médio de 614 ± 752 gr, mantidos no
Laboratório de Educação Física e Saúde na Universidade Católica de Brasília. Os
animais foram alimentados com ração (Purina®) e água. A temperatura ambiente
foi controlada a 25°C, com fotoperíodo de claro/escuro de 12 horas. O estudo
está de acordo com os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação
animal (COBEA) e foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação animal
(CEEA) em 26.08.2008, n. 026, folha 59 do livro 02.
Os ratos foram divididos em 2 grupos (p> .05), sendo um grupo controle (GC) n=
5 que não participaram do treinamento, com massa corporal (MC) média de 614.0 ±
83 gr, e um grupo treinado (GT) n= 5, submetidos ao treinamento, com MC média
de 617 ± 78 gr.
Instrumentos e Procedimentos
A adaptação ao meio líquido consistiu em manter os ratos em contato com a água
em tanques à temperatura de 30 ± 2°C, durante 2 semanas, 5 vezes por semana,
por 30 minutos (Gobatto et al., 2001). Foram realizados testes incrementais na
natação para avaliação da capacidade aeróbia dos animais. Os testes consistiram
de uma sobrecarga inicial referente ao PC do animal com incrementos de 1% da MC
a cada 3 min até a exaustão. Pausas de 1 min foram realizadas entre os estágios
para troca de cargas e coleta sanguínea (Cunha et al., 2009).
Foi realizado um corte na porção distal da cauda dos animais e amostras
sanguíneas de 25 μl foram coletadas e colocadas em microtubos contendo 50 μl de
solução de fluoreto de sódio a 1%. As dosagens de lactato foram feitas pelo
método eletroenzimático (Yellow Springs Instruments ' USA 2700 ' STAT).
A determinação do LL foi realizada a partir do ajuste polinomial da resposta da
razão [LAC]/carga durante o teste incremental (Limiar de Lactato polinomial -
LLp) (Cunha et al., 2009).
O protocolo de treinamento foi realizado somente com o GT durante 8 semanas,
sendo numa frequência de 5 vezes por semana com duração de 30 minutos cada
sessão. A carga do treinamento correspondeu à mesma intensidade do Lan, ou
seja, uma sobrecarga de 5% do PC para cada animal (Gobatto et al., 2001). A
eutanásia ocorreu após o treinamento.
Após o sacrifício dos animais coletou-se 5 mm da aorta. As amostras foram
embebidas na solução fixadora de Karnovsky modificada, contendo solução de
glutaldeído 3% (Merck®, Alemanha) e formaldeído 1% (Sigma®, USA) em tampão
cacodilato de sódio (EMS®, BRA {0.125M; pH 7.4}) por 72 hs a 4°C. Em seguida, o
material foi submetido à desidratação com passagens sucessivas em soluções de
concentrações crescentes de etanóis e diafanizado pelo xilol. A inclusão foi
feita em parafina histológica (56 ' 58)°C. Foram realizados cortes de 6 μm de
espessura em um micrótomo (Leica DMR®), onde os cortes foram coletados em
lâminas para microscopia (Knittel®, Alemanha), desparafinizados em estufa a
58°C e banhados em séries de xilois; hidratados em soluções de concentrações
decrescentes de etanóis e lavados em água destilada.
Foram feitas 3 colorações (Figuras 1A-D): Hematoxilina ' Eosina (HE) (Romeis,
1968), para análise morfométrica dos componentes da túnica média da aorta:
núcleo de músculo liso, distância entre os feixes de núcleo de músculo liso
vascular; Hematoxilina férrica de Verhoeff (Prophet et al., 1992; Verhoeff,
1908) para coloração de fibras elásticas maduras, resorcina de Weigert para
coloração de fibras elásticas maduras, resorcina de Weigert pós-oxidação com
solução aquosa a 1% de oxona (Montes, 1996) para coloração de fibras elásticas
maduras, eulanínicas e oxitalâmicas. As secções foram desidratadas em soluções
de concentrações crescentes de etanóis, diafanizadas em série de xilois, e as
lâminas montadas com lamínula e meio de montagem para microscopia (Entellan®,
Merck®, Alemanha).
Figura_1. Fotomicrografias da parede da parte ascendente da aorta. A ' Fibras
elásticas maduras evidenciadas pela técnica de Verhoff; B ' Lamelas de fibras
elásticas em um vaso de um animal treinado com natação (Weigert); C ' Núcleos
das células musculares lisas (HE); D ' Lamelas em um vaso de rato sedentário
(Weigert com oxona)
As imagens da aorta foram capturadas e medidas utilizando-se um microscópio
trinocular (Carl Zeiss Microimagin®, modelo Axioshop 40, Alemanha) acoplado a
uma vídeo-câmera (Axio Cam HRC ' ZEISS®, Alemanha), conectada a um computador e
a um monitor de 17 polegadas. Foram obtidas imagens com um plano focal pequeno.
Por meio de um sistema de imagem computadorizado (Software Axion Vision® KS400
Rel. 4.6, Alemanha) foram capturadas imagens das secções histológicas em toda a
sua extensão (Brüel, Oxlund, & Nyengaard, 2005). Os cortes corados com
Weigert foram analisados com objetiva de 100x sob imersão, dos quais foram
selecionados 10 cortes de cada vaso, de 3 animais de cada grupo. Nos cortes, as
áreas externa (Ae) e interna (Ai) foram determinados pelo contorno das
membranas elásticas externa e interna. Os diâmetros externos (De) foram obtidos
pela medida das superfícies da adventícia e o diâmetro interno (Di) desde a
superfície do endotélio. As medidas da área da secção transversa (AST) foram
obtidas pela diferença entre Ae ' Ai (AST= Ae - Ai); a δ da túnica média foi
obtida dividindo-se por 2 a diferença entre o De ' Di (δ = De - Di/2) e a razão
média/luz foi obtida pela razão entre a δ e o Di (R m/lz = δ/Di). De acordo com
Mulvany (2002), o conhecimento do Di e δ da túnica média são parâmetros
importantes para indicar a quantidade de material na artéria, fornecendo
informações sobre os processos biológicos que determinam a estrutura vascular
com relação ao crescimento e/ou regressão.
A quantificação pela técnica da estereologia da túnica média foi realizada com
a objetiva de 100X sob imersão no mesmo sistema de aquisição de imagem citado
no item anterior, onde foram capturadas imagens das secções histológicas (Brüel
et al., 2005). Foi estudado o número (n.), a densidade numérica (QA) de núcleos
(Mandarim-de-Lacerda, 1995) e a distância entre os (Figura_1C) núcleos do
músculo liso vascular (do centro de um núcleo à outro), bem como densidade de
volume (VV) do componente elástico (lamelas e fibrilas) da túnica média da
aorta. Segundo Owens e Schwartz (1982), os cálculos de QA de núcleo e VV de
lamelas refletem alterações proporcionais da SMC. A análise estereológica em
relação às variáveis n. núcleos e densidade numérica de núcleos (QA[nu]), foram
feitas médias com 3 animais de cada grupo. Na variável distância entre os
feixes do núcleo do músculo liso (Figura_1C), foram analisados 5 animais por
grupo e 100 feixes por animal. Na variável densidade de volume de lamela VV
[lam], a análise estereológica foi feita em 6 campos, aleatórios por animal, 4
animais por grupo. A contagem de pontos das lâminas coradas com HE, utilizando
as imagens capturadas ao microscópio com aumento de 100x, foi sobreposta sobre
as mesmas em um sistema ' teste formado por pontos ' teste em forma de cruz,
equidistante o suficiente para que fossem contados os pontos sobre a estrutura
de interesse, obtendo-se o maior grau de acurácia na quantificação (Mandarim-
de-Lacerda, 1995; Van Vré et al., 2007), onde os perfis de interesse foram os
núcleos de SMC. A contagem de pontos da coloração Verhoeff, onde também foram
utilizadas as imagens capturadas do microscópio com aumento de 50x, também foi
sobreposto sobre elas um sistema-teste formado por pontos-teste em forma de
cruz, sendo a área de contagem delimitada por uma frame sem viés, formada por
linhas de inclusão e exclusão, com a distância entre os pontos de 1.7 cm, sendo
um total de 100 pontos (Brüel et al., 2005), onde o perfil de interesse foram a
lamelas elásticas. A contagem de pontos foi realizada através do sistema-teste,
contendo 300 pontos, onde a distância entre os pontos foi de 1.7 cm, sendo este
sistema-teste colocado sobreposto à imagem na tela do monitor. Os parâmetros
estereológicos analisados foram os seguintes: Cálculo da VV da SMC e do
componente elástico (lamelas e fibrilas), obtida pela fórmula: VV = PP/PT
(%).Onde: PP é o número de pontos que tocam a estrutura em estudo; PT é o n.
total de pontos do sistema teste multiplicado pelo n. de campos. Para obtenção
da Vv, portanto foi realizada a somatória dos valores de todos os campos
contados por animal, sendo o resultado desta somatória dividido pelo PT. O
Cálculo da QA da SMC obtida pela fórmula: QA = N/At, sendo o N o n. de pontos
que tocam os núcleos das SMCs dentro da área teste (At) e nas linhas
tracejadas. At corresponde à área de 1.7 cm entre os pontos, onde a frame
possuía um total = 600 pontos. Para obtenção da QA, foi realizada a somatória
dos valores de todos os campos contados por animal. Esse valor foi
posteriormente dividido por At.
Análise Estatística
Estatística descritiva com valores de média e desvio padrão (± DP) foi
aplicada. Procedimentos para aplicação de função polinomial de segunda ordem
foram utilizados para determinação das intensidades relativas ao LLp. Teste-
t de Student não pareado foi utilizado para comparações entre grupos. O nível
de significância foi p≤ .05 (SPSS v.10.0 e Microsoft Excel).
RESULTADOS
Após a análise do percentual do PC referente ao LLp para os GC e GT verificou-
se que as comparações entre os resultados pré e pós treinamento dos grupos não
apresentaram diferenças. Quando as comparações foram realizadas entre o GC com
GT, verificou-se que o GC apresentou maior LLp que o GT, tanto no momento pré
como no pós treinamento (p < .05). Analisando os resultados do PC foi possível
notar que treinamento inibiu o aumento do PC dos animais do GT e que o mesmo
não ocorreu no GC, pois, os pesos verificados pós-treinamento foram maiores que
no pré-treinamento (p< .05) GC. Em relação à variável do peso de 5 mm da aorta,
não apresentaram diferenças entre os grupos pós treinamento (Tabela1).
Tabela 1
Média e Desvio Padrão das variáveis da área externa (Ae), interna (Ai),
diâmetro externo (De), interno (Di), razão média/luz (R md/lz), área de secção
transversa (AST) e peso da aorta para os grupos controle (GC) e treinado (GT)
As áreas e diâmetros da aorta possibilitaram verificar que a Ae, a Ai, o De, o
Di e a R md/lz, não apresentaram diferenças entre os grupos. Já a AST
apresentou-se maior no GT do que no GC (p< .05) (Tabela 1).
Quanto aos resultados do estudo da parede da aorta verificou-se que o GT foi o
que apresentou maior δ (GC = 102.02 ± 4.47; GT = 119.06 ± 6.29; p< .05).
Entretanto, ao analisar as SMC foi possível notar que o n. de núcleos (GC =
55.94 ± 9.24; GT = 59.84 ± 6.83; p= .44) bem como sua QA (GC = 1364.49 ±
166.81; GT = 1459.49 ± 225.38; p= .44) não apresentaram diferenças estatísticas
entre os GC e GT, permitindo considerar que as modificações de δ observadas
sejam justificadas a partir do aumento do sistema elástico da parede. Estima-se
que este desenvolvimento é graças a uma maior Vv de lamelas elásticas em sua
parede (figura 2).
Figura 2. Estudo do sistema elástico da parede da Aorta* p < .05 em relação ao
grupo controle (GC).
Outro resultado referente às modificações da parede da aorta devido ao
protocolo de exercício utilizado são os dados apresentados na figura 3, que
contem à distância entre os feixes de músculo liso na parede arterial e sua
distribuição para os GC e GT. A aorta do GS apresentou mais de 90% dos feixes
com distância entre 2 μm e 4 μm, sendo que feixes com distância de 2 μm são os
mais frequentes (56%). O GT apresentou 7% dos feixes com distância de 2 μm.
Ainda, observe que maior parte dos feixes musculares lisos possui distância de
6 μm (22%) e que mais de 60% dos feixes apresentaram distância de 4 μm a 10 μm.
Por fim, enquanto o GS nem apresentou feixes com distância maior que 8 μm, no
GT verificaram-se feixes com até 22 μm de distância.
Figura 3. Histograma da distância entre os feixes de músculo liso para os
grupos controle e treinado
DISCUSSÃO e CONCLUSÕES
O estudo avaliou sob os aspectos morfoquantitativos as mudanças da aorta de
Wistar idosos treinados em natação na intensidade do limiar anaeróbio. O
treinamento promoveu um aumento (p< .05) na espessura, área de secção
transversa, fibras elásticas e na distância entre os feixes do núcleo de
músculo liso sem influenciar no diâmetro da aorta. Horta et al. (2005),
verificaram os efeitos do treinamento em esteira, 1 h/dia, 5 dias/semana,
durante 20 semanas, sobre a remodelação da aorta em ratos normotensos e SHR. Os
autores analisaram a δ total da parede da aorta e da túnica média e verificaram
o n. de lamelas e constataram que o exercício foi eficaz para manter a
estrutura da aorta dos SHR em condições similares a dos normotensos. Em relação
ao Di da aorta, os dados demonstram que no GT, o exercício não promoveu um
aumento em relação ao GC. Este dado corrobora com os resultados de Segal,
Kurjiaka, e Caston (1993), que treinaram ratos Sprague-Dawley, durante 16
semanas em corrida, 7 vezes por semana, 3 hs/dia, a uma intensidade de 65 - 80%
do VO2 máx., onde também não observou diferença entre os GT e GC. Esses dados
vão contra os resultados de outros autores, onde ocorreu uma diminuição da luz
das arteríolas durante o desenvolvimento da hipertensão (Briones et al., 2006;
Folkow, 1982).
Stevenson, Feleki, Rechnitzer, e Beaton (1964), demonstraram um aumento do
diâmetro de artéria de ratos exercitados, onde foram associados ao aumento do
coração e uma mudança adaptativa devido à alterações hemodinâmicas. No que se
refere à Rmd/lz das aortas dos animais utilizados no estudo, não foram
observadas diferenças entre os grupos. Segundo Mulvany (2002), quando há um
aumento dessa razão pode ser devido à hipertrofia, hiperplasia e remodelagem da
musculatura lisa vascular. A ação do exercício em reduzir essa razão é
importante, porque está relacionada com a resistência do vaso. Quanto maior a
Rmd/luz, maior é a resistência do vaso ao fluxo sanguíneo e consequentemente
maior será a pressão. Ainda de acordo com o mesmo autor, artérias de
resistência apresentam um processo de remodelamento eutrófico interno, sem
alteração na composição dos materiais constituintes. Entretanto, em decorrência
das diferenças estruturais encontradas em artérias, o processo de remodelamento
difere (Bund, 2001). Em relação à δ da parede da aorta, ocorreu um aumento no
GT, quando comparado com o GC, corroborando com os achados de Segal et al.
(1993). Sendo que, quando analisamos o n. e a densidade de núcleos de SMC e a
distância entre os feixes, concordamos que foi devido à hipertrofia da SMC ou
um aumento da MEC em resposta ao aumento do estresse da parede do vaso durante
o exercício. Ao contrário dos resultados de Horta, Carvalho, e Mandarim-de-
Lacerda (2005), onde um grupo SHR foi submetido ao exercício 1h/dia, 5 dias/
semana, durante 20 semanas. Quando comparados os grupos Wistar sedentários e
SHR-EX com o grupo SHR-SED, apresentaram menor δ artérial e maior QA de
núcleos. Matsuda et al. (1989), concluíram que a natação realizada por ratos
idosos, treinados 1h/dia, 6 dias/semana, durante 16 semanas resultou em uma
aorta mais forte e extensível, o que está relacionado com a maior quantidade de
elastina e com menos alterações degenerativas. Uma das limitações do estudo,
foi devido a perda do número da amostra no micrótomo na hora de dissecar a
aorta, futuros estudos necessitam ser realizados para observar se o diâmetro da
aorta ascendente sobre alterações com uma amostra aumentada. Em relação à Vv de
lamelas elásticas e os resultados acima, concluímos que a aorta ascendente de
wistar idosos, treinados em natação no LL durante 8 semanas, apresentaram um
aumento da δ sem alterar o Di. Essa adaptação deveu-se à hipertrofia de SMC ou
um aumento das lamelas elásticas ocasionando uma artéria mais forte e
conseqüentemente reduzindo o estresse tangencial na artéria durante o exercício
e o repouso.
