Controlo biológico do cancro do castanheiro: Deteção, identificação e
caracterização do Hypovirus - CHV1
Introdução
O castanheiro europeu (Castanea sativa Mill.) é uma cultura muito importante no
sistema agroflorestal das regiões montanhosas de Portugal. A ampla difusão de
castanheiros no país está essencialmente relacionado com variedades cultivadas
em soutos para a produção de castanha e madeira. Na região de Trás-os-Montes é
uma espécie muito importante, em 2006, aproximadamente 85% da área dos soutos
de Portugal encontram-se nesta zona do país (Baptista et al., 2010). Durante o
último século, microrganismos patogénicos invasores foram responsáveis pelo
surgimento de algumas epidemias. A doença da tinta (Phytophthora
cinnamomiRands) tem afetado soutos desde o início do século passado (Dinis et
al., 2011), porém, o cancro do castanheiro tornou-se a principal causa da
mortalidade de castanheiros desde o seu estabelecimento em 1989 (Abreu, 1992).
O cancro do castanheiro é causado pelo fungo Cryphonectria parasitica(Murrill)
Barr,e tem provocado o declínio dos soutos de castanheiros em toda a Europa,
incluindo Portugal (Robin e Heiniger, 2001). C. parasitica é um fungo
ascomyceta (Diaporthales) e é nativo do Este asiático (Prospero e Rigling,
2013).
A infeção por este fungo está tipicamente associado com o aparecimento de uma
necrose extensiva (cancro) na casca dos ramos e tronco (Prospero et al., 2013;
Heiniger e Rigling, 1994). Os cancros podem aumentar rapidamente de tamanho nas
zonas infetadas, resultando na morte subsequente da planta na zona infetada
(Prospero et al., 2013) causando graves dados ambientais e económicos.
A hipovirulência é um mecanismo mediado pela presença no citoplasma de C.
parasitica do Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) (Heiniger e Rigling, 1994), um
vírus dsRNA não encapsulado do género Hypovirus (Choi e Nuss, 1992;
Anagnostakis e Day, 1979; Dawe e Nuss, 2001). A infeção de C. parasitica por
hipovirus não só torna o isolado menos virulento, como causa inúmeras mudanças
fenotípicas, incluindo a redução da pigmentação, redução da esporulação
assexuada e perda da fertilidade quando é a componente recetora (Nuss, 2005).
Os hipovirus podem ser transmitidos horizontalmente por esporos assexuados e a
transmissão entre fungos hipovirulentos e virulentos ocorre por troca
citoplasmática após o contacto de hifas entre dois micélios (Van Alfen et al.,
1975). A formação de uma anastomose e, consequentemente, o sucesso da
transmissão do hipovirus é controlada por um sistema de compatibilidade
vegetativa (vic genes) envolvendo pelo menos seis vic locibialélicos não
ligados (Cortesi e Milgroom, 1998). Quando duas estirpes de C. parasitica são
compatíveis, são do mesmo grupo de compatibilidade vegetativa (vc-type),
exibindo assim, a mesma combinação dos alelos em todos os vic loci (Prospero e
Rigling, 2013).
A incidência e a distribuição geográfica do vc-type em C. parasitica tem sido
extensivamente estudada na Europa (Cortesi et al., 1996; Homs et al., 2001;
Robin et al., 2010) que permitiram definir isolados de vc-types comuns (Eu-
testers), estando identificados e caracterizados 74 vc-typesdiferentes(Cortesi
e Milgroom, 1998; Robin et al., 2000). Em Portugal, os estudos no início da
epidemia identificaram a presença de dois vc-type diferentes (Gouveia et al,
2001) e estudos posteriores (Bragança et al., 2007) indicaram a presença de
sete vc-typeeuropeus que foi possível associar à lista dos EU-testers e mais
dois grupos que não foi possível associar a nenhum número da referida lista,
mantendo-se no entanto o EU-11 como o grupo dominante.
O controlo biológico por hipovirulencia é considerado um método eficiente para
o controlo da doença promovendo a recuperação das árvores atacadas (Heiniger e
Rigling, 1994; Robin e Heiniger, 2001; Cortesi et al., 1998). O objetivo deste
estudo foi detetar, identificar e caracterizar os hypovirus (CHV1) presentes
nos isolados brancos de C. parasitica isolados em cancros curados na região de
Trás-os-Montes.
Material e métodos
Identificação morfológica das estirpes hipovirulentas
A deteção de estirpes hipovirulentos de C. parasitica foi baseada na análise
morfológica dos isolados. Para a obtenção de isolados de C. parasitica pequenos
troços foram retirados dos tecidos que apresentavam sintomas de cancro e
desinfetados em etanol a 70% durante 3 minutos e passados pela chama.
Estes fragmentos são colocados em placas de Petri contendo meio de cultura
Potato Dextrose Agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA) e são incubados a 25±1ºC às
escuras por 7 dias. Para deteção da Hipovirulência os isolados, depois de
purificados, são transferidos para uma nova placa de Petri com PDA para se
obter a purificação do isolado, e são incubados a 25±2ºC durante 7 dias às
escuras a que se seguem 5 dias de incubação à luz e temperatura do laboratório.
Os isolados que no final deste período mantiverem a cor branca são considerados
isolados de C. parasitica hipovirulentos. Os isolados com micélio de cor
alaranjada e com formação de esporos de cor laranja avermelhada são
considerados isolados virulentos de C. parasitica.
Deteção e Identificação molecular do hipovirus (CHV1)
A presença do vírus responsável pela hipovirulência (Cryphonectria hypovirus)
foi verificada nas colónias que apresentaram pigmentação e esporulação
reduzida, através da presença de RNA de cadeia dupla (dsRNA). Para a extração
de dsRNA, os isolados que apresentaram características morfológicas de
hipovirulência foram colocados a crescer em placas de Petri com meio PDA
cobertas com celofane por 7 dias a 25ºC no escuro. O fungo foi removido do
celofane e macerado com a utilização de azoto liquido. O RNA total foi isolado
do micélio utilizando o kit da NorGen BioTek (Thorold, ON, Canada). A extração
foi feita utilizando tampão de lise e precipitado com etanol a 100% e lavado em
colunas com solução de lavagem. No final o RNA total foi dissolvido com tampão
de eluição e guardado a -20ºC.
Sintese de cDNA
O cDNA foi sintetizado através de uma diluição de 3µl de RNA total em 11µl de
água livre de RNase e incubado a 100ºC por 2 minutos. A diluição de RNA foi
misturada com 4µl de 5x Reaction Mix (Sigma) e 2µl Maxima Enzyme Mix (Sigma) e
incubada nas seguintes condições: 10 minutos a 25ºC, 30 minutos a 50ºC e 5
minutos a 85ºC.
Uma PCR foi realizada utilizando diferentes conjuntos de primers conhecidos por
amplificarem diferentes subtipos de CHV1. A região ORF-A foi amplificada
utilizando os primers hvep-1F (5'-TGACACGGAAGCTGAGTGTC-3') (Gobbin et al.,
2003) e EP-721-4 (5'-GGAAGTCGGACATGCCCTG-3') (Bryner et al., 2012), para a
região ORF-B foram utilizados os primers orfB-12aF (5'- AGACCTCAATCGGGTCTCCCT-
3') e orfB-12aR (5'- TTCAACCACACGACGAGTTCG-3'), primers modificados de ORF-B-
12, Rigling (não publicado).
A amplificação da PCR foi realizada em 50µl de uma mistura de reação contendo
cDNA (1µL com 10ng), pares de primers (10pmoL/uL cada), 2X Jump Start (Sigma).
As condições de reação do termociclador foram as seguintes: 2 minutos a 94 ºC,
33 ciclos de 1 minuto a 94 ºC, 1,5 minutos a 55 ºC e 2 minutos a 72 ºC, e 8
minutos a 72 ºC de extensão final. Os produtos de PCR foram fracionados por
eletroforese num gel de agarose a 1,5% com TBE a 80V usando 100pb de DNA Ladder
como marcador molecular, colorido com GelRed e visualizado nos UV. A
sequenciação dos produtos PCR foi realizado pela StabVida laboratories
(Caparica, Portugal). As relações filogenéticas entre os hipovirus foram
construídas usando o unweighted pair group method with arithmetic mean (UPGMA)
conjuntamente com o modelo K80, o algoritmo neighbour-joining (NJ). Os
hypovirus foram analisados simultaneamente com sequências dos subtipos CHV-
1 italiano, francês e alemão (EP721/subtype I. Euro7/subtype F1, 2103/subtype
F2 and M1372/subtype D (Gobbin et al., 2003) (resultados não apresentados).
Compatibilidade vegetativa
A compatibilidade vegetativa dos isolados foi avaliado de acordo de uma
resposta barrage/marge através do pareamento de pares de isolados crescidos em
meio de cultura (Anagnostakis et al., 1986; Bissegger et al., 1997). Os
isolados foram pareados com os EU-testers identificados em Portugal.
Resultados
Um total de 11 isolados pertencendo todos ao vc-type EU-11, foram identificados
morfologicamente pelo seu aspeto branco e sem produção de esporos quando
crescidos em meio PDA, característica típica de estirpes hipovirulentas de C.
parasitica. Todos os isolados apresentaram uma banda (tanto para ORF-A como
para ORF-B) ≈780pb depois de uma eletroforese em gel de agarose. As sequências
amplificadas foram sequenciadas e comparadas com sequências publicadas na base
de dados de GenBank mediante uma análise BLAST, as sequências obtidas
apresentaram uma similaridade nucleótida superior a 97% pertencendo ao grupo
Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) do subtipo italiano CHV1-I.
A árvore filogenética demonstrou que dos 11 isolados testados, 10 dos isolados
apresentavam uma sequência idêntica para a região ORF-A (Figura_1). Sendo todos
eles isolados no concelho de Valpaços, oito na freguesia de São João da
Corveira (RB112, RBD23, RBC1021, RBC1051, RBC101, RB1/1, RBB111 e RB11.1) e
dois na freguesia de Padrela e Tazém (121.80.2.2 e 121.40.1). Um isolado obtido
na freguesia de Padrela e Tazém (121.80.2.1) revelou uma maior distância
filogenética dos restantes mencionados anteriormente. Relativamente à região
ORF-B (Figura_2), sete isolados apresentaram uma sequência idêntica entre eles,
sendo cinco deles obtidos na freguesia de São João da Corveira (RBD23, RBC1021,
RBC1051, RBC101, RB1/1 e RBB111) e dois na freguesia de Padrela e Tazém
(121.80.2.2 e 121.40.1).
Discussão
Neste estudo, foram identificados 11 estirpes hiovirulentas de Cryphonectria
parasiticano concelho de Valpaços. Os hipovirus são transmitidos para as
estirpes virulentas de
C. parasitica por anastomose das hifas e que ocorre apenas quando os isolados
pertencem ao mesmo grupo de compatibilidade vegetativa (vc-type) (Prospero e
Rigling, 2013). Todos os isolados estudados pertencem ao vc-type EU-11, grupo
dominante nesta região como o referido por outros autores em trabalhos
realizados anteriormente (Bragança et al., 2007), sendo o vc-type dos isolados
hipovirulentos (EU-11) igual ao vc-type dominante na região a capacidade de
conversão dos fungos agressivos por parte dos fungos hipovirulentos será muito
elevada situação que potencia a eficácia da hipovirulência como meio de luta
contra o cancro do castanheiro.
No estudo realizado no concelho de Valpaços foram identificados 11 isolados de
C. parasitica que apresentavam as características morfológicas típicas das
estirpes hipovirulentas. Em todos os isolados foi identificado a presença de
hipovírus CHV1. A análise das sequências indicou que todos os isolados de
hipovírus pertencem ao grupo Cryphonectria hypovirus 1 (CHV1) do subtipo
italiano CHV1-I. Apesar de anteriormente já terem sido detetadas estirpes
hipovirulentas de C. parasiticaem Portugal (Bragança et al., 2007, Gouveia et
al, 2010), apenas neste trabalho foi feita a sua caracterização molecular. A
hipovirulência foi também detetada e caracterizada em Castilla y Léon, região
geograficamente próxima do norte de Portugal (Zamora et al., 2012; Montenegro
et al., 2008), no entanto pode verificar-se que os subtipos aí encontrados são
diferentes, e incluídos no subtipo francês CHV1-F1. O subtipo italiano foi
encontrado em várias zonas da Europa (Robin et al., 2010; Sotirovski et al.,
2006), na Península Ibérica apenas foi detetado na Catalunha (Homs et al.,
2001). Assim, pode concluir-se que não existe relação entre a hipovirulência
presente nas regiões do Norte de Portugal e de Castilla y Léon em Espanha,
apesar da sua proximidade geográfica e de o grupo de compatibilidade dominante
ser em ambas as regiões o EU-11. Estes resultados sugerem que a hipovirulência
introduzida no nordeste transmontano proveniente de Espanha, é de origem
diferente nas duas regiões.
Apesar de se observar um aumento de isolados de fenótipo branco e de estar
presente o hipovírus CHV1 como se verificou nos isolados estudados a
hipovirulência não é ainda generalizada nem muito frequente em Portugal. A
baixa incidência da hipovirulência é observada em regiões onde C. parasitica se
estabeleceu recentemente (Hoegger et al., 2000; Perlerou e Diamandis, 2006;
Montenegro et al., 2008), pois normalmente o seu aparecimento surge apenas
depois de 10 a 25 anos da introdução da doença (Robin e Heiniger, 2001).
Em vários países da Europa têm sido feito esforços para introduzir a
hipovirulência como meio de luta contar o Cancro do castanheiro (Prospero e
Rigling, 2013). A presença de hipovirulência natural no nordeste de Portugal é
de grande importância para que o tratamento biológico do Cancro do castanheiro
possa ser utilizado em Portugal. A realização deste trabalho contribui
decisivamente para a caracterização dos subtipos de hypovirus presentes em
Portugal, sendo assim um marcador molecular para avaliação futura da dispersão
dos hypovirus no país.
