Modelo experimental de esteatohepatite não-alcoólica com dieta deficiente em
metionina e colina
GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGY
Modelo experimental de esteatohepatite não-alcoólica com dieta deficiente em
metionina e colina
Model of experimental nonalcoholic steatohepatitis from use of methionine and
choline deficient diet
Idilio Zamin Jr.; Angelo Alves de Mattos; Ângelo Zambam de Mattos; Eduardo
Migon; Ernesto Soares; Marcos Luiz Santos Perry
Curso de Pós-Graduação em Hepatologia da Fundação Faculdade Federal de Ciências
Médicas de Porto Alegre, RS
Correspondência
INTRODUÇÃO
A esteatohepatite não-alcóolica (EHNA) é caracterizada por acúmulo de gordura
no fígado associado a graus variáveis de inflamação e fibrose. Esta doença
apresenta forte associação com obesidade, sexo feminino e diabete melito (DM)
(5, 30, 31, 48).
Atualmente, no ocidente, a EHNA tem sido considerada ora a segunda(12), ora a
terceira(9) doença hepática mais comum em pacientes de ambulatório. Em nosso
meio, ao serem avaliados prospectivamente, 912 indivíduos obesos, sem DM
associado, em ambulatório de nutrição, foi possível determinar, pela primeira
vez em estudo populacional e não de uma série de casos, prevalência de
esteatohepatite não-alcoólica da ordem de 3,18%(56). Essa prevalência, no
entanto, é subestimada, uma vez que só foram avaliados os pacientes com
alterações de aminotransferases.
A despeito de apresentar alta prevalência na população, a história natural de
EHNA ainda é pouco estudada. Atualmente, acredita-se que a EHNA possa evoluir
para cirrose e carcinoma hepatocelular (CHC), enquanto a esteatose isolada não
costuma apresentar esta evolução. Ressalta-se existirem poucos estudos
prospectivos na literatura, com biopsias sequenciais, em pacientes com EHNA com
o intuito de avaliar a progressão da doença(5, 25, 43).
O reconhecimento do seu potencial evolutivo e a sua alta prevalência são os
principais motivos que despertam o interesse da comunidade científica em
relação ao seu estudo(4, 5, 8, 9, 13, 25, 30, 32, 43, 44, 48, 49, 50, 51, 53,
55).
A respeito do tratamento da EHNA, até o presente momento, nenhuma terapia
específica mostrou resultados conclusivos. Enquanto a maioria dos autores
acredita que os pacientes que apresentam esteatose devem ser apenas observados
e avaliados periodicamente, muito tem se estudado em relação à terapêutica da
EHNA. Embora alguns trabalhos sugiram que a redução gradual de peso em
pacientes obesos(14, 38, 43) e a realização regular de atividade física
aeróbica possam ter efeito benéfico(2, 4, 12, 35, 46, 55) , mais estudos com
seguimento histológico são necessários para demonstrar se essa conduta ocasiona
regressão das lesões hepáticas a longo prazo(3, 11, 52).
Em relação ao tratamento medicamentoso da EHNA, há poucos estudos testando
drogas em seres humanos(10, 16, 21, 22, 23, 29, 31, 33, 36, 54), sendo que uma
das grandes dificuldades observadas é a necessidade da realização de segunda
biopsia hepática, uma vez ser esta a única maneira fidedigna de avaliar o
efeito da droga na evolução da EHNA. Assim, torna-se de grande relevância
testar a eficácia terapêutica em modelos animais de EHNA.
Tendo em vista o custo de linhagens de ratos geneticamente modificadas para a
realização destes estudos, é importante que se consiga um modelo experimental
de EHNA adaptado à necessidade do nosso meio.
Este estudo teve como objetivo desenvolver um modelo experimental de EHNA a
partir do uso de dieta deficiente em metionina e colina (DMC).
MÉTODO
Animais
Nesse experimento, foram utilizados 50 ratos machos, com 45 dias de idade,
pesando entre 200 e 250 g, da espécie Rattus norvegicus, da linhagem Wistar,
heterozigotos. Os animais foram provenientes do Biotério da Fundação Faculdade
Federal de Ciência Médicas de Porto Alegre (FFFCMPA), Porto Alegre, RS. Esses
ratos foram mantidos em gaiolas de polipropileno com dimensões de 47 x 34 x 18
cm, em conjuntos de cinco animais por gaiola, sob um ciclo claro/escuro de 12 h
(ciclo claro das 7 às 19 h) e sob condições controladas de temperatura (22ºC ±
2,0ºC).
Dieta
A dieta DMC foi processada no Laboratório da Faculdade de Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, segundo o modelo de ROGERS e
NEWBERNE(45) modificado, para a indução de EHNA, sendo composta por:
* caseína livre de vitaminas 6%;
* óleo de soja 45%;
* amido 41% ;
* fibras 1%;
* mistura vitamínica 2% (acetato de vitamina A 0,03; vitamina D 0,003;
menadiona 0,001; acetato de vitamina E 0,045; tiamina 0,001; riboflavina
0,002; piridoxina 0,001; ácido p-aminobenzóico 0,01; biotina 0,00005;
nicotinamida 0,005; pantotenato de cálcio 0,005; inositol 0,02; ácido
ascórbico 0,02);
* sais 5%.
Procedimento experimental
O modelo de indução de EHNA foi realizado mediante alimentação dos animais com
dieta pobre em metionina e colina(45) ad libitum durante 90 dias. A água foi
oferecida ad libitum através de mamadeiras de vidro com bico de inox em rolha
de borracha.
O animais foram divididos, aleatoriamente, em dois grupos:
* grupo 1: 10 ratos receberam ração padronizada (Nuvilab CR-1- Nuvital
Nutrientes Ltda®) durante 3 meses;
* grupo 2: 40 ratos receberam dieta deficiente em metionina e colina
durante 3 meses.
Coleta dos materiais e morte dos animais
No primeiro dia do estudo, foi determinado o peso dos animais. Um dia após o
término do período de indução (90 dias), os animais foram novamente pesados e
mortos por decapitação. Então, foi realizada laparotomia com hepatectomia total
e preparo do material para análise macroscópica e histológica.
Os fígados foram seccionados e o lobo direito colocado em fixador de Bouin
(solução composta por ácido pícrico, formol e ácido acético), permanecendo
nessa solução por aproximadamente 4 horas, para, então, ser lavado em água
corrente. Após, o material foi transferido para frascos com álcool 50%, onde
permaneceu por 30 minutos. Por último, os fígados foram armazenados em frascos
com álcool 70%, aguardando o processo para inclusão em parafina.
Análise histológica
Inicialmente, foi realizado estudo macroscópico dos fígados retirados. Para a
avaliação microscópica, as lâminas dos fragmentos hepáticos foram coradas com
hematoxilina-eosina, picro-sirius, para avaliação do grau de fibrose, e Perls,
para avaliação da presença de depósitos de ferro, tendo sido examinadas por um
único patologista, "às cegas" em relação aos dados dos animais.
O critério histológico mínimo para o diagnóstico de EHNA foi a presença de
esteatose associada à balonização hepatocelular, envolvendo a zona 3 e
infiltrado inflamatório lobular(7, 17). Os corpúsculos de Mallory e a fibrose
sinusoidal, envolvendo a zona 3, podiam ou não estar presentes(7, 17).
A graduação tanto da atividade necroinflamatória como da fibrose foi realizada,
segundo a classificação proposta por BRUNT et al.(7).
Comitê de Ética
Este projeto de pesquisa foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
estudo animal da FFFCMPA. Todos os ratos foram manipulados, observando-se
rigorosamente, as normas institucionais para trabalhos experimentais com
animais preconizadas por esse Comitê.
Análise estatística
Foram calculadas as médias e o desvio padrão de todas as variáveis
quantitativas e ordinais. No caso dos escores, optou-se por realizar
transformação em postos antes da comparação dos grupos. A comparação foi feita
por análise de variância com critério de classificação, que quando aplicada
sobre os postos, é equivalente ao procedimento de Kruskal-Wallis. A localização
de eventuais diferenças entre os grupos baseou-se no procedimento de Tukey,
executado sobre os postos (quando necessário). As variáveis dicotômicas foram
comparadas pelo teste exato de Fisher. O nível de significância do estudo foi
estabelecido emα= 0,05. Os dados foram analisados no programa SPSS v12.0(1,
34).
RESULTADOS
Dos 50 ratos que foram submetidos ao estudo, 49 completaram os 90 dias da
dieta. Apenas um rato foi a óbito durante o período de estudo.
Peso dos animais
O peso inicial dos animais foi semelhante entre os grupos, porém os ratos que
receberam a dieta DMC apresentaram perda significativa de peso ao final dos 90
dias, com achados de desnutrição. Ao contrário, o grupo que recebeu ração
apresentou ganho de peso (Tabela_1 e Figuras_1 e 2).
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Aspecto macroscópico dos fígados
Em relação ao exame macroscópico dos fígados, todos os animais que receberam
ração apresentaram fígado com aspecto e coloração normal. Enquanto isso, os
animais que receberam a dieta DMC apresentaram fígado aumentado de tamanho, com
coloração esbranquiçada e, em alguns espécimes, puderam ser observadas áreas
amareladas de depósitos de gordura (Figuras_3 e 4).
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Histologia
Em relação aos achados histológicos, nenhum dos 10 ratos que recebeu ração
apresentou alterações histológicas, sendo considerados como tendo fígado
normal.
Dentre os 39 ratos que receberam a dieta DMC, todos apresentaram, pelo menos,
algum grau de esteatose macrovesicular, que sempre foi predominante em relação
à microvesicular.
O diagnóstico de esteatohepatite não-alcoólica foi realizado em 27 (70%) dos 39
ratos que receberam a dieta DMC (Figura_5).
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Em relação à atividade inflamatória, esta esteve ausente em 12 ratos, sendo que
13 ratos apresentaram grau 1, 8 grau 2, e outros 6 animais apresentaram grau 3.
Embora ausente em 19 casos, a fibrose foi considerada estágio 1 em 13 ratos,
estágio 2 em 1, estágio 3 em 5, e um rato apresentou cirrose (estágio 4). Em
relação aos demais aspectos histológicos, não foram observados depósitos de
ferro e a presença de corpúsculos de Mallory ocorreu em apenas cinco casos.
DISCUSSÃO
A utilização de modelos animais com EHNA é muito importante no estudo desta
doença, pois pode permitir melhor entendimento de sua fisiopatologia, ajudar a
esclarecer os mecanismos envolvidos na transição da esteatose para a EHNA, bem
como testar o resultado das várias drogas disponíveis para o seu tratamento. A
indução de EHNA tem sido realizada de diferentes maneiras: por indução
medicamentosa (tetraciclina, amiodarona, corticosteróides, entre outros); com a
utilização de ratos geneticamente obesos ou com manipulação genética e com a
utilização de dietas que promovem a sua ocorrência, seja por serem ricas em
gordura, seja por restrição de aminoácidos(19, 26, 40, 45, 54).
As drogas podem induzir esteatose e EHNA ao inibir aβ-oxidação mitocondrial de
ácidos graxos, como ocorre com a amiodarona, as tetraciclinas e os
corticosteróides, entre outros, ou também, ao bloquear a liberação de
triacilgliceróis do fígado, proporcionando consequentemente, o seu acúmulo,
como ocorre, por exemplo, com o ácido valpróico(26). LETTÉRON et al.(26)
conseguiram a indução de esteatose em ratos com a administração de diversas
drogas (amiodarona, doxiciclina, etanol, tetraciclina, ácido valpróico e
dexametasona) em diferentes raças de animais. A maioria dos animais apresentou
esteatose predominantemente microvesicular, à exceção do grupo que recebeu
etanol, no qual a forma de esteatose predominante foi macrovesicular. Este
modelo de indução de esteatose e esteatohepatite, apesar de eficaz, certamente,
na maioria das vezes, não traduz patogênese semelhante à da EHNA e também pode
refletir a hepatotoxicidade específica da droga, confundindo os resultados dos
estudos quando avaliado o papel de determinado medicamento em sua prevenção.
Desta forma, não parece ser a melhor opção para modelos experimentais que se
propõem a estudar a EHNA.
Os modelos genéticos de EHNA utilizam animais que possuem alguma mutação
espontânea que promove a doença ou linhagens de animais geneticamente
modificadas em laboratório, que desenvolverão EHNA(20).
Os ratos ob/ob são o principal exemplo de animais que apresentam mutação
espontânea que bloqueia a produção de leptina(20, 39). À semelhança dos
humanos, estes animais apresentam hiperinsulinemia (resistência à insulina),
hiperglicemia e dislipidemia, e desenvolvem esteatose(39). Na deficiência de
leptina, ocorre importante esteatose, porém a esteatohepatite somente ocorre se
houver outro estímulo hepatotóxico como, por exemplo, o uso de alguma droga ou
a indução de isquemia(47).
Outra linhagem de ratos geneticamente obesos são os fa/ fa, que desenvolvem
mutação espontânea no gene do receptor da leptina(41). Desta forma, apesar de
produzirem o hormônio, apresentam resistência periférica ao mesmo, com efeito
final semelhante ao que ocorre com os ratos ob/ob, porém sem responder à
administração exógena de leptina(20).
Em laboratório de genética, consegue-se realizar modificações gênicas e a
produção de linhagens de animais que desenvolvem esteatose. Existem várias
intervenções que podem ser realizadas em genes diferentes com objetivo
semelhante, ou seja, gerar desequilíbrio na homeostasia dos lipídios, de forma
que ocorra a formação de esteatose. Uma das principais modificações genéticas
utilizadas nesses modelos é a ativação de genes envolvidos na síntese de ácidos
graxos e colesterol, promovendo a lipogênese e a deposição de gordura no fígado
(20).
Tanto os ratos com mutação natural que induz a esteatose e a EHNA, como aqueles
geneticamente modificados, são excelentes modelos experimentais para estudo
desta doença e são utilizados, rotineiramente, com tal propósito em pesquisas
(6, 18, 28). Tratam-se, porém, de modelos onerosos, pela dificuldade de
aquisição de linhagens com mutação espontânea ou pela necessidade de técnicas
sofisticadas realizadas em laboratório de biologia molecular, pouco disponíveis
em nosso meio. Dessa forma, torna-se difícil a utilização desses modelos na
maioria das pesquisas.
A indução de EHNA também é possível em modelos animais através de manipulação
da dieta, de forma a promover a deposição de lipídios no fígado. Nesse sentido,
podem-se utilizar dietas que promovam a obesidade e a esteatose ou dietas que
induzam somente a deposição de gordura hepática, sem a ocorrência de obesidade.
Como a doença hepática gordurosa não-alcoólica (DHGNA) está fortemente
associada à obesidade, alguns estudos em modelos experimentais a induzem e,
dessa forma, esperam a ocorrência posterior de esteatose e EHNA. Entretanto, à
semelhança dos seres humanos, os ratos apresentam respostas e suscetibilidade
diferentes à dieta, sendo que tanto a ocorrência de obesidade como
posteriormente a DHGNA, dependem de outros fatores, como idade, gênero e
predisposição genética. Dentre as diversas dietas com este propósito, aquelas
com elevadas quantidades de lipídios ou glicídios são as mais utilizadas(27,
42).
Ao contrário do que acontece com as dietas anteriormente descritas, os animais
que são alimentados com dieta deficiente em metionina e colina apresentam perda
de peso e importante desnutrição(19, 54). Esses aminoácidos essenciais possuem
papel fundamental na síntese das apoproteínas, que são proteínas especializadas
no transporte dos lipídios no plasma, favorecendo, na sua ausência, o acúmulo
dos mesmos no fígado(19, 54). Além disso, com a dieta DMC, a ß-oxidação
mitocondrial de lipídios fica reduzida, contribuindo para a ocorrência de
esteatose. O mecanismo da produção desse modelo também se vale do fato de que a
metionina e a colina são precursores essenciais para a síntese hepática de
fosfatidilcolina que, junto com o colesterol, perfaz a maioria absoluta dos
lipídios secretados na bile(20).
Historicamente, essa dieta foi descrita por ROGERS e NEWBERNE(45), em 1973, ao
observarem que poderia ocorrer o desenvolvimento de cirrose em um modelo
animal, apenas com manipulação da dieta e sem o uso de álcool. Os autores
demonstraram que a utilização de dieta deficiente dos aminoácidos colina e
metionina, mas rica em lipídios, induz importante esteatose e doença hepática
semelhante à observada com o uso de álcool. Quanto mais deficiente em
aminoácidos, ficou comprovada maior velocidade de instalação e gravidade da
doença hepática. Nesse estudo, os autores descreveram e testaram três
composições com graus progressivos de deficiência nutricional, mas não
relataram a percentagem de esteatose e EHNA obtida com cada dieta. Esse modelo
de dieta DMC vem sendo utilizado até hoje com o propósito de indução de EHNA em
modelos animais.
No presente estudo, foram encontradas várias dificuldades para a elaboração da
dieta e, em modelo inicial, ocorreu falha na indução da esteatose e EHNA,
apesar de ter sido seguida a base da fórmula descrita originalmente. Somente
após adaptação da dieta, de acordo com as substâncias disponíveis em nosso
meio, é que foi conseguido êxito na indução da doença. Entre outros fatores,
foi observado que os ratos têm a capacidade de sintetizar a metionina e a
colina por rota metabólica alternativa, a partir do ácido fólico, que também
deve ser removido da dieta para que a mesma seja eficaz.
OKAN et al.(37), com a finalidade de testar o papel do ácido ursodesoxicólico
na EHNA, realizaram sua indução em ratos Wistar, utilizando dieta DMC. Os
autores empregaram uma forma industrializada da dieta, disponível
comercialmente nos Estados Unidos. Ao final de 30 dias, foi observada esteatose
em 19 (52,7%) dos 36 ratos submetidos a dieta. A EHNA, porém, ocorreu em apenas
cinco (13,8%) ratos. Por outro lado, WELTMAN et al.(54), também utilizando uma
forma comercial da dieta DMC, conseguiram a indução de esteatose em todos os
seis animais submetidos ao estudo, após 4 semanas de tratamento. Como o
objetivo do estudo era avaliar a atividade do citocromo CYP2E1 e a
lipoperoxidação, os autores não citaram quantos ratos desenvolveram EHNA.
Chamaram atenção, entretanto, para a importante perda de peso que esta dieta
induz nos animais.
A maioria dos estudos em modelos animais(24, 37, 54) que utiliza a dieta DMC
para a indução de EHNA, usou uma forma industrializada dessa dieta e somente
citou o laboratório que a produziu. Apenas GRATTAGLIANO et al.(15), apesar de
também utilizarem forma industrial da dieta, descreveram detalhadamente sua
fórmula. Nesse estudo, após 10 dias de dieta, os autores observaram esteatose
macrovesicular significativa em todos os 14 animais avaliados porém,
provavelmente pelo curto período, não foi observada a ocorrência de EHNA.
No presente estudo, foi utilizada a dieta DMC para a indução de EHNA,
desenvolvida de maneira artesanal, seguindo o modelo proposto por ROGERS e
NEWBERNE(45). Todos os animais estudados, com exceção de um, concluíram o
protocolo proposto.
À semelhança dos outros estudos(15, 24, 37, 54), os animais que utilizaram a
dieta DMC apresentaram perda significativa de peso ao final dos 90 dias de
tratamento, com sinais inequívocos de desnutrição protéico-calórica.
Com a administração dessa dieta por 90 dias, obteve-se a indução de esteatose
em 100% dos animais. Esta pôde ser avaliada já macroscopicamente, pois os
animais submetidos ao tratamento apresentaram fígado aumentado de tamanho, com
coloração esbranquiçada, podendo ser observadas áreas amareladas de depósitos
de gordura em alguns espécimes. Ao analisar-se a histologia, todos os ratos
apresentaram, pelo menos, algum grau de esteatose macrovesicular, que sempre
foi predominante em relação à microvesicular, indo ao encontro dos demais
estudos que utilizam dieta DMC para a indução de EHNA(15, 24, 37, 54).
O diagnóstico de esteatohepatite não-alcoólica foi realizado em 27 (70%) dos 39
animais submetidos a dieta DMC. Esses achados confirmam que a dieta utilizada é
altamente eficaz para a indução da doença. Os estudos que utilizam a dieta DMC
não especificam exatamente quantos animais desenvolveram a EHNA para
comparação.
O presente estudo comprovou, pois, que a utilização de dieta com restrição de
metionina e colina, produzida de forma não-comercial, é eficaz e se destaca,
entre as várias maneiras de induzir EHNA em modelos animais, pelo baixo custo e
pelo fato de poder ser facilmente manipulada em laboratório, sem a necessidade
de técnicas sofisticadas. É também importante destacar o fato deste modelo não
necessitar o uso de droga para a indução da doença e, principalmente, de
apresentar elevados índices de indução de esteatose e EHNA. Assim, fica
sugerido este modelo como padrão para os estudos experimentais em EHNA, uma vez
que apresenta baixo custo e elevada eficácia.
