Elevação dos níveis séricos de laminina na cirrose hepática induzida pelo
tetracloreto de carbono
GASTROENTEROLOGIA EXPERIMENTAL EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGY
Elevação dos níveis séricos de laminina na cirrose hepática induzida pelo
tetracloreto de carbono
Increased serum levels of laminin in the experimental cirrhosis induced by
carbon tetrachloride
Lindalva Batista Neves; Regina Maria Catarino; Maria Regina Regis Silva; Edison
Roberto Parise
Disciplina de Gastroenterologia ' Departamento de Medicina da Universidade
Federal de São Paulo ' Escola Paulista de Medicina, São Paulo, SP
Endereco_para_correspondência
INTRODUÇÃO
Níveis elevados de laminina, glicoproteína da matriz extracelular (MEC), têm
sido observados na circulação periférica de portadores de cirrose hepática,
correlacionando-se com o grau de hipertensão portal nesses pacientes(5, 8, 9).
Essa elevação dos níveis séricos tem sido creditada a maior deposição dessa
glicoproteína no espaço de Disse, acompanhando a capilarização dos sinusóides
hepáticos observada na cirrose hepática(6). Estudos em humanos(7) e em modelos
experimentais(10,11) demonstram aumento na deposição dessa glicoproteína no
tecido hepático, mais especificamente ao longo do espaço de Disse, à medida que
progride a fibrose no fígado. Por outro lado, níveis circulantes elevados dessa
glicoproteína têm sido observados em outras doenças não-cirróticas que cursam
com fibrose hepática e hipertensão portal(17).
Neste trabalho procurou-se avaliar os valores séricos de laminina na
intoxicação crônica experimental pelo tetracloreto de carbono (CCl4) e sua
correlação com fibrose experimentalmente induzida, uma vez que esse modelo pode
possibilitar estudos mais amplos sobre o metabolismo da laminina e os fatores
que determinam sua elevação na cirrose hepática.
MATERIAL E MÉTODOS
Quarenta e nove ratos machos adultos da linhagem Wistar foram divididos em dois
grupos: um grupo-controle, constituído de 16 animais submetidos a gavagem
orogástrica com óleo mineral, na dose de 0,5 mL semanal, e um grupo tratado com
CCl4 composto por 33 animais, que foram submetidos a gavagem com solução de
CCl4 a 8% em óleo mineral, com dose inicial de 0,5 mL semanal e doses
subseqüentes calculadas de acordo com o ganho ou a perda de peso, seguindo
modelo previamente descrito(24). Entre a 6a e a 16a semana de experimento,
semanalmente, um rato do grupo-controle e quatro ratos da mesma idade, mas
tratados com CCl4, foram sacrificados, após cateterização da veia porta com
medida da pressão portal em coluna líquida contendo solução salina 0,9%.
Amostras de sangue foram coletadas na veia femoral, centrifugadas e armazenadas
a -20oC, até a determinação da laminina sérica.
Fragmentos de tecido hepático foram fixados em solução de formol 10% tamponado
para análise histológica após colorações pelos métodos de hematoxilina-eosina
(HE), tricrômio de Masson, reticulina, picrus sirius e prata de gomori. A
fibrose hepática foi classificada de forma semi-quantitativa em cruzes, onde:
(0) = ausência de fibrose, (+) = fibrose perivenular, (++) = fibrose septal
incompleta, (+++) = fibrose septal completa e (++++) = cirrose, de acordo com
classificação utilizada previamente(2,15).
A determinação da concentração de laminina circulante foi realizada pela
técnica de ensaio imunoenzimático (ELISA) de duplo anticorpo(21), utilizando-se
anticorpo antilaminina (aLNM), desenvolvido a partir de laminina isolada de
tumor de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS)(30). Os anticorpos foram
purificados em coluna de afinidade Sepharose CNBr 4B ativada, utilizados na
titulação de 1/100. As determinacões séricas foram realizadas em triplicatas e
a leitura da reação realizada em espectrofotômetro em comprimento de onda de
492 nm e os valores expressos em µg/dL.
O protocolo foi previamente analisado e aprovado pelo Comitê de Ética da
Universidade Federal de São Paulo, Escola Paulista de Medicina. Os valores das
concentrações séricas de laminina foram expressos como médias + desvios padrões
(média + DP). Para análise comparativa dos valores de laminina nos diferentes
grupos estudados, empregou-se a análise de variância não-paramétrica para
postos de Kruskal-Wallis, complementada pelo teste de Dunn. A correlação entre
valores de laminina e dos níveis de pressão portal com e os diferentes graus de
fibrose hepática foi feita pelo índice de correlação de Spearmann, enquanto o
índice de Pearson foi utilizado na correlação entre valores de laminina e de
pressão portal(3).
RESULTADOS
No grupo CCl4 (n = 33) houve aumento progressivo do tecido fibroso hepático,
iniciando-se pela fibrose perivenular, até cirrose. A cirrose foi observada
(Figura_1) nos animais sacrificados a partir da 12a semana.
Para avaliação comparativa dos valores séricos de laminina entre os grupos e
pelo fato de apenas três animais terem apresentado fibrose septal incompleta, e
seus valores de laminina não diferirem significativamente dos observados no
grupo com fibrose septal completa, esses dois grupos foram unidos em um só, que
recebeu a denominação de fibrose septal. Assim compostos os grupos, observou-se
que os valores médios da concentração de laminina no sangue periférico do grupo
com cirrose hepática (40,0 + 18,7 µg/dL) foi significativamente superior à
média dos valores obtidos nos demais grupos: grupos-controle (13,8 + 12,1 µg/
dL), fibrose perivenular (19,1 + 15,5 µg/dL) e fibrose septal (22,2 + 27,0 µg/
dL) (Tabela_1). Houve uma correlação significativa entre os níveis de laminina
e o grau de fibrose hepática (rs = 0,59; P < 0,01; n = 49; Figura_2). Houve
também correlação significativa dos níveis de pressão portal com os diferentes
graus de fibrose hepática (rs = 0,82; P < 0,001; n = 49; Figura_3) e com os
níveis séricos de laminina (r = 0,29; P < 0,05; n = 45; Figura_4).
DISCUSSÃO
O modelo experimental utilizado reproduz a fibrose hepática que ocorre em
pacientes cirróticos e apresenta alterações histológicas, imunohistoquímicas e
ultra-estruturais da matriz extracelular bem caracterizadas(11, 12, 16, 18,
27). O grande problema durante a indução da fibrose e cirrose pelo CCl4 nesses
animais é a variação de resposta à toxina, em função da idade e sexo do animal,
além da via, tempo de administração e dose da substância tóxica(18, 19, 20).
Por isto, além de padronizar as condições do experimento, optou-se por agrupar
os animais estudados em função da fibrose hepática observada à histologia e não
pelo tempo de intoxicação ou número de injeções de CCl4.
O CCl4 leva a repetidos fenômenos necroinflamatórios no fígado, que evoluem com
alterações fibróticas, inicialmente focais e posteriormente difusas, resultando
em aumento da deposição de elementos do tecido conjuntivo e da pressão na veia
porta(20, 29, 31).
A análise histológica do tecido hepático mostrou as alterações características
do modelo que validaram a classificação de fibrose utilizada(24, 16, 19, 28).
A despeito da ampla utilização dos valores séricos de laminina nas doenças
hepáticas e da correlação entre níveis séricos e pressão portal(5, 8, 9), resta
saber a exata participação do fígado na elevação de suas concentrações e a
relação com a doença hepática. Diante da grande distribuição de laminina nas
membranas basais do organismo e a pequena participação na MEC do fígado,
algumas questões necessitam ser investigadas e esclarecidas. A correlação entre
pressão portal e níveis de laminina sérica na doença hepática crônica não tem
sido observada por todos os autores(1).
No presente estudo utilizou-se anticorpo policlonal antilaminina de camundongo
(aLNM) que apresenta extensa reação cruzada com a laminina de rato(14, 23, 26).
A média das concentrações de laminina sérica nos ratos-controle foi próximo ao
observado na literatura(14). Esses valores aumentam em média, até quatro vezes
em animais com cirrose hepática. Embora haja tendência a aumento progressivo da
laminina, com o grau de fibrose, apenas animais cirróticos apresentam valores
estatisticamente superiores aos controles. Houve correlação estatisticamente
significativa entre concentração de laminina no sangue periférico e nível de
pressão portal, porém com baixo grau de inter-relação entre si (r2 = 0,09),
pela grande dispersão de valores tanto no grupo-controle, como no grupo CCl4.
Por outro lado, a correlação entre a laminina no sangue periférico e graus de
fibrose hepática, mostra melhor coeficiente de correlação (rs = 0,59) do que
com a pressão portal. Esses achados associados a excelente correlação entre
hipertensão portal e grau de fibrose (rs = 0,82) sugerem que níveis de laminina
sérica circulante e de pressão portal não tenham relação causa-efeito e os
valores de laminina sejam apenas reflexo do grau de fibrose hepática, fator
este sim, determinante ou mais diretamente relacionado com hipertensão portal.
Torna-se óbvia a necessidade de avaliação do grau de deposição de laminina no
fígado desses animais tanto nos sinusóides, quanto nos septos fibrosos para
avaliar se nesses animais há correlação entre a capilarização dos sinusóides e
a deposição de laminina no espaço de Disse e se o "turnover" alterado
dessa glicoproteína seria responsável pela correlação entre seus valores
séricos e a pressão portal, como observado em portadores de fibrose e cirrose
hepáticas(4, 5, 13, 22, 25).
