Potencialidades de extratos e óleos essenciais de coentro, oregão e poejo como
meio de protecção contra bacterioses do tomateiro
INTRODUÇÃO
O tomateiro (Lycopersicon esculentum Mill.) é atualmente uma das hortícolas
mais consumidas a nível mundial, quer em fresco quer após transformação e
processamento industrial, devido à menor perecibilidade comparativamente com
outras hortícolas, à versatilidade da sua utilização e ao seu valor alimentar.
Porém, as infecções causadas por bactérias, fungos, vírus ou nemátodes, causam
prejuízos económicos elevados, representando um problema grave da produção de
tomate.
Os meios de protecção disponíveis contra bactérias que causam doenças no
tomateiro são reduzidos, principalmente no modo de produção biológico. Este
problema deve-se à escassez de compostos antibacterianos comerciais adequados e
eficazes. A utilização de antibióticos, além de proibida em muitos países, pode
não ser eficaz. As aplicações de compostos de cobre podem ser eficazes para
reduzir o estabelecimento do inóculo, no entanto, é conhecida a resistência de
certas bactérias ao cobre. Adicionalmente, estes compostos apresentam vários
problemas de fitotoxicidade, acumulação no solo e necessidade de se efectuarem
aplicações frequentes. Além destes aspectos, acrescem as restrições europeias
recentes, que limitam o uso de sais de cobre (Balestra et al., 2009).
No contexto atual, em que a opinião pública manifesta grande preocupação
relativamente à utilização de pesticidas e à presença dos seus resíduos nos
alimentos, bem como relativamente aos seus impactos negativos causados no
ambiente, a investigação sobre o uso de extratos de plantas assume especial
relevância (Lo Cantore et al., 2004; Matos, 2010).
As plantas aromáticas (PAM) caracterizam-se por segregarem e acumularem óleos
essenciais em estruturas especializadas. Estes óleos são constituídos por
compostos voláteis pertencentes a vários grupos químicos, arrastáveis pelo
vapor de água, praticamente insolúveis na água mas solúveis nos solventes
orgânicos e nas gorduras (Cunha et al., 2007).
Dada a importância da cultura do tomateiro em Portugal e sabendo-se que, de
entre os factores bióticos que conduzem a prejuízos nesta cultura (Cruz, 2010;
Moura et al., 2004), se destacam as doenças causadas por bactérias, este
trabalho teve como objectivo estudar as potencialidades antimicrobianas in
vitro de Coriandrum sativumL., Origanum vulgarL. eMentha pulegiumL.
relativamente às bactérias P. corrugata, P. mediterranea e P. syringaepv.
tomato e como meio de protecção contra as doenças que estas bactérias causam no
tomateiro, em comparação com o padrão oxicloreto de cobre.
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal
Os extratos e óleos essenciais de C. sativumL. (coentro), O. vulgar L.(orégão)
e M. pulegiumL. (poejo) foram fornecidos, em parte, pelo Departamento de
Fisiologia Vegetal (INRB L-INIA) e outra parte (coentro), produzidos de acordo
com o modo de produção biológico, na quinta pertencente à associação de pais e
amigos de crianças inadaptadas, em Barcelos. No caso dos extratos e óleos
essenciais de orégão e poejo, foram também utilizadas formulações
antibacterianas comerciais (produzido de acordo com o modo produção biológico).
Para a obtenção de extratos e óleos essenciais de poejo, foram ainda colhidas
plantas numa área de vegetação espontânea, localizada na freguesia de Anjo do
concelho de Vieira do Minho. O material vegetal colhido, folhas, flores e
sementes, foi seco à sombra, em local arejado e à temperatura ambiente, moído
manualmente antes de proceder à preparação das diferentes formulações obtidas
por diferentes métodos de extracção e testados em diferentes concentrações
(Quadro_1). Os extratos etanólicos foram obtidos por contacto com o solvente,
enquanto os óleos foram obtidos por arrastamento de vapor em Clavanger.
Os extratos aquosos de O. vulgare foram obtidos a partir de 100 g de material
vegetal (sumidades de orégãos) em 500 mL de água destilada, por maceração a
frio durante 24 horas, à temperatura ambiente e em escuro, e a quente, por
fervura durante 20 minutos e repouso durante 3 horas. Os extratos foram
concentrados num evaporador rotativo sob vácuo (Quadro_2).
Os extratos etanólicos e óleos essenciais foram obtidos a partir de C. sativum,
O. vulgare M. pulegium.Os extratos etanólicos foram obtidos de modo semelhante
ao descrito para o extrato aquoso a frio e os óleos essenciais foram obtidos
por arrastamento de vapor, em Clavager, conforme descrito por Barros et al.
(2011).
Estirpes bacterianas, meios de cultura e inoculação
Foram selecionadas três bactérias patogénicas do tomateiro, duas bactérias
responsáveis pela medula negra do tomateiro, P. corrugata(estirpe A344)e P.
mediterranea (estirpe A54) isoladas em Portugal (Moura, 2005) e a estirpe tipo
de P. syringae pv. tomato (LMG 5039). Os meios de cultura foram,
respectivamente, LPGA e King B e a temperatura de incubação de 28ºC.
Acção antibacteriana d e extratos vegetais e óleos essenciais in vitro
Para o estudo de actividade antibacteriana in vitro, foram utilizadas culturas
puras com 24 horas de crescimento das estirpes referidas. Prepararam-se
suspensões bacterianas cuja concentração foi ajustada a 108 ufc ml-1. Placas,
com meio de cultura apropriado, foram inoculadas com 100 µl de cada suspensão
bacteriana. Após 24-48 horas, os extratos aquosos e etanólicos foram aplicados
em orifícios no agar (10 mm Ø), duas doses por placa (Quadros_3 e 4). Por cada
modalidade foi preparada a testemunha só com água esterilizada. Os ensaios com
os óleos essenciais foram realizados por difusão em discos de papel (5 mm Ø),
colocados sobre a superfície do meio de cultura, em placas preparadas como
anteriormente descrito. Tanto os extratos como os óleos foram testados na
inibição de P. corrugata-A344, P. mediterranea-A54 e P. syringae pv. tomato -
LMG 5039. Cada ensaio foi realizado em triplicado.
A actividade antibacteriana foi avaliada com base no diâmetro do halo de
inibição do crescimento bacteriano, após incubação a 28ºC, até uma fase de
crescimento exponencial. Os dados foram analisados utilizando o software SPSS
12.0. Quando os pressupostos da ANOVA foram verificados, efectuou-se a análise
da variância e as médias dos halos de inibição foram comparados pelo teste da
diferença mínima significativa (LSD). Os testes estatísticos de Mann-Whitney
foram utilizados quando não se verificaram os pressupostos necessários à
realização da ANOVA.
Acção antibacteriana in planta - ensaio em estufa
Uma parte do trabalho experimental decorreu numa estufa com cobertura de
polietileno, pertencente à Associação de Pais e Amigos de Crianças Inadaptadas
do concelho de Barcelos, durante Agosto a Outubro de 2010. Plantas de tomateiro
da cultivar Marmande com 20 dias, obtidas por sementeira, foram transplantadas
para vasos de 10 litros de capacidade. Após 3 dias, quando as plantas
apresentavam 8 a 9 folhas, procedeu-se à sua pulverização até ao ponto de
escorrimento (Balestra et al., 2009) com os extratos etanólicos (5 mg ml-1) e
óleos essenciais (0,1%) de coentro, orégão e poejo, no volume de 25 mL por
planta. Como padrão, as plantas foram pulverizadas com oxicloreto de cobre (2,5
g l-1). O estudo relativo à doença da pinta negra do tomateiro (P. syringae pv.
tomato) decorreu na estufa de polietileno pertencente à ESAPL, durante Setembro
a Novembro de 2011, tendo-se utilizado plantas de tomateiro da cultivar Coração
de Boi. O ensaio decorreu em vasos e a metodologia utilizada para pulverização
dos tomateiros foi a já descrita para a cultivar Marmande.
Produção de inóculo e inoculação de tomateiros
As suspensões utilizadas (108 ufc ml-1) para inoculação de tomateiros foram
preparadas a partir de culturas bacterianas com 24 horas de crescimento a 28
ºC, em meio LPGA e King B de acordo com procedimento descrito previamente. Após
72 horas, procedeu-se à inoculação dos tomateiros com as estirpes A344 de P.
corrugata, A54 de P. mediterranea e LMG 5039 de P. syringae pv. tomato.Pelo
facto de P. corrugata-A344 e P. mediterranea-A54 serem bactérias que colonizam
a medula do tomateiro e os tecidos vasculares da planta, manifestando os
sintomas típicos da doença no interior do caule, os tomateiros foram inoculados
por injecção no caule, utilizando 0,5 ml de cada suspensão bacteriana (Moura,
2005). A inoculação de P.syringae pv. tomato foi realizada de acordo com a
metodologia descrita por Balestra et al. (2009), pulverizando uniformemente as
folhas de tomateiro com 1,5 ml de inóculo por planta.
Como testemunha, o mesmo número de plantas foi inoculado com água destilada
esterilizada, tendo-se inoculado, no total, 96 plantas. Após a inoculação, os
tomateiros foram regados e cobertos, durante 2 dias, com o filme de polietileno
transparente, para criar condições favoráveis à infecção das plantas. Por cada
tratamento (espécie vegetal, extrato/óleo essencial) ou estirpe bacteriana,
utilizaram-se 4 plantas (uma planta por vaso).
Avaliação da acção antibacteriana de extratos vegetais e óleos essenciais em
plantas de tomateiro
O efeito da aplicação de extratos etanólicos e óleos essenciais de coentro,
orégão e poejo na severidade da doença da medula negra, causada por P.
corrugata eP. mediterranea (ensaio 1) foi avaliado 60 dias após a inoculação
dos tomateiros, através da observação dos sintomas internos e da medição do
comprimento da lesão total (cm) no interior do caule, desenvolvida a partir do
ponto de inoculação. O efeito da aplicação de extratos etanólicos e óleos
essenciais de coentro, orégão e poejo na doença da pinta negra do tomateiro,
causada por P. syringaepv.tomato(ensaio 2) foi avaliado 15 dias após inoculação
das folhas, através da observação e registo da presença de lesões típicas na
sua superfície. A incidência da doença (ID) foi determinada pelo número de
folíolos com sintomas por cada planta inoculada e a severidade da doença (SD)
foi determinada pelo número de necroses por folíolo por cada planta inoculada.
O delineamento experimental (ensaio 1) consistiu num ensaios em vasos com 4
blocos causalizados e 24 tratamentos diferentes, resultantes da seguinte
estrutura fatorial com 3 fatores:
Fator 1: espécies vegetais com 3 níveis (coentro, orégão e poejo);
Fator 2: espécies bacterianas com 2 níveis: P. corrugata e P. mediterranea);
Fator 3: formulações antibacterianas com 4 níveis [extratos etanólicos, óleos
essenciais, oxicloreto cobre (padrão) e água (testemunha)].
O ensaio 2 foi idêntico, tendo o fator 2, apenas 1 nível: P. syringae pv.
tomato.
Os dados foram analisados utilizando o software SPSS 12.0. Efetuou-se a análise
de variância e as médias das populações foram comparadas pelo teste da
diferença mínima significativa (LSD).
A classificação toxicológica e ecotoxicológica do oxicloreto de cobre
apresentam-se no Quadro_3.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Extratos aquosos
Os resultados dos testes de ação antibacterianain vitro, são apresentados nas
Figuras_1, 2 e 3. Não se observaram diferenças significativa entre os
resultados dos extratos obtidos a frio e a quente para qualquer das espécies.
Após aumento da concentração (76,6 mg ml-1 na formulação obtida a quente e
157,43 mg ml-1 na formulação obtida a frio), evidenciou-se a actividade do
extrato de orégão obtido a quente (Figura_1), tendo P.
syringaepv.tomatoapresentado halos de inibição significativamente maiores (p<
0,05) do que os observados nas estirpes A344 de P. corrugatae A54 deP.
mediterranea. O aumento da concentração do extrato aquoso de orégão a frio,
revelou alguma atividade inibitória consistente 48 horas após incubação apenas
no caso das bactérias P. mediterraneaeP. syringae pv. tomato.
Os extratos aquosos de orégão obtidos a quente na dose de 250 µl inibem o
crescimento das 3 bactérias, 48 horas após incubação. As inibições bacterianas
mais significativas verificaram-se a quente, sobretudo sobre P. syringae pv.
tomato, 48 horas após incubação (20, 87±4,26mm).
Extratos etanólicos
A atividade antibacteriana dos extratos etanólicos de coentro, orégão e poejo
(Figura_2a), expressa a significância dos resultados observados. Das 3 espécies
de plantas utilizadas, conclui-se que os extratos etanólicos de coentro são os
que têm maior actividade biológica in vitro, excepto contra a bactériaP.
syringae a qual foi também 100% inibida com os extratos de orégão e de poejo.
A bactéria P. syringae pv.tomatofoi a mais sensível à acção dos extratos
etanólicos de orégão e poejo. Não se registaram diferenças significativas entre
as bactérias com a aplicação do extrato etanólico de coentro. Contrariamente, a
utilização de orégão e poejo, inibiu de forma significativamente diferente o
crescimento das estirpes A344 de P. corrugata, A54 deP. mediterraneaeLMG 5039
de P. syringae pv.tomato.
Óleos essenciais
A actividade antibacteriana dos óleos essenciais testados quanto às suas
potencialidades de inibição do crescimento in vitro das bactérias P. corrugata,
P. mediterranea e P. syringae pv. tomato evidencia a maior susceptibilidade de
P. syringae relativamente aos diferentes óleos essenciais, sendo P.
mediterranea a menos susceptível (Figura_2b).
O facto dos óleos essenciais terem sido mais abrangentes quanto à actividade
antimicrobiana era esperado, pois são conhecidos pela sua actividade
antimicrobiana e potencialidades no controlo de doenças de plantas causadas por
bactérias (Magro et al., 2008, Matos, 2010). O óleo essencial de coentro foi o
mais eficaz na inibição do crescimento das bactérias, sendo este resultado mais
evidente na espécie P. syringaepv. tomato, que registou 100% de inibição.
Contrariamente, a utilização de orégão e poejo, inibiu de forma
significativamente diferente o crescimento das estirpes A344 de P. corrugata,
A54 de P. mediterranea e a estirpe LMG 5039 de P. syringae pv. tomato (Figura
2b).
Actividade antibacteriana in planta
A análise dos resultados obtidos no estudo de bioactividade de extratos
etanólicos e óleos essenciais, obtidos in plantasobreP. corrugataeP.
mediterranea(Figura_3 e Quadro_4) evidenciou que a doença causada por estas
duas espécies bacterianas traduziu-se, em média, por lesões de 2,21 ± 1,43 cm,
e 3,21 ± 2,08 cm, respectivamente. A severidade da doença causada por P.
corrugata-A344 e P.mediterranea-A54, referida nas Figura_3a e 3b mostra que não
houve diferenças significativas entre as espécies bacterianas, quando
submetidas à aplicação dos de extratos etanólicos , óleos essenciais e
oxicloreto de cobre, não existindo interação entre as diferentes formulações
antibacterianas e as duas espécies bacterianas (Figura_3a). As plantas
testemunha, pulverizadas apenas com água, sofreram danos por infecções
criptogâmicas, que por terem interferido no crescimento dos tomateiros foram
excluídas desta análise.
Apesar dos sintomasda doença causada pelas bactérias P. corrugata e P.
mediterranea terem sido idênticas às referidas por outros autores (Lopez et
al., 1994; Moura, 2005), a severidade da doença foi claramente inferior à
descrita em estudos realizados com as mesmas estirpes bacterianas na região de
Ponte de Lima (Moura et al., 2005). Este facto poderá ser justificado pela
suscetibilidade das cultivares, e devido à época do ano em se realizaram os
diferentes ensaios em estufa.
Os resultados do estudo de bioactividade obtidos in planta sobre P.
syringaepv.tomato (estirpe LMG 5039) não mostram diferenças significativasda
incidência da doença (Figura_4 e Quadro_5. A severidade com que a doença se
manifestou também não registou qualquer diferença entre os tomateiros
pulverizados com os extratos etanólicos, óleos essenciais ou oxicloreto de
cobre (padrão) e os tomateiros inoculados sem qualquer tratamento (testemunha).
CONCLUSÃO
Os ensaios realizados in vitro, mostram que os extratos aquosos e etanólicos, e
os óleos essenciais obtidos a partir de C. sativum, O. vulgar e M. pulegium
apresentam actividade antimicrobiana, inibindo o crescimento de P. corrugata,
P. mediterranea, P. syringae pv. tomato, bactérias patogénicas do tomateiro. A
actividade antibacteriana de Mentha pulegium contra os agentes responsáveis da
medula negra do tomateiro (P. corrugata e P. mediterranea) e da doença da pinta
negra(P. syringae pv. tomato) foi demonstrada pela primeira vez.
Nos ensaios realizados in planta, os extratos etanólicos e os óleos essenciais
de coentro, orégão e poejo conduziram a resultados não concordantes com os
obtidos in vitro. Nas condições experimentais, e no caso da doença da medula
negra do tomateiro, a pulverização de tomateiros com extratos etanólicos e
óleos essenciais de coentro, orégão e poejo, teve efeito idêntico ao obtido com
o padrão oxicloreto de cobre, podendo ser alternativa a este composto de cobre.
