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Efeito do lipopolissacarídio bacteriano sobre o esvaziamento gástrico de ratos: avaliação do pré-tratamento com dexametasona e azul de metileno EXPERIMENTAL GASTROENTEROLOGYINTRODUÇÃO O lipopolissacarídio (LPS) bacteriano determina, em animais, retardo do esvaziamento gástrico (EG) de líquidos e sólidos(20, 36). Em ratos, utilizando a via intravenosa (iv) e doses menores de LPS, o retardo do EG de uma refeição líquida foi precoce, intenso nas primeiras horas e correlacionado com a dose (8). Estudo adicional demonstrou que o pré-tratamento com o próprio LPS aboliu este efeito, reproduzindo para o EG, o fenômeno de tolerância precoce, já descrito para outras alterações produzidas pela endotoxina(9). Muitos dos efeitos do LPS em animais podem ser atribuídos a fatores liberados na fase aguda da inflamação, estando entre estes as citocinas(4, 12, 18, 39) e óxido nítrico (ON)(35). Há evidências da participação do ON nos mecanismos fisiológicos de relaxamento do piloro(28), fundo gástrico(3, 10) e duodeno(24).

O fenômeno inibitório da atividade motora da musculatura lisa decorreria da ativação da guanilato-ciclase solúvel, na célula muscular, pelo ON produzido nesta célula a partir da ligação do VIP, liberado nas terminações não- colinérgicas não-adrenérgicas entéricas, com receptores localizados na membrana celular(15, 23, 31). A síntese do ON a partir de L-arginina depende da ação das ON-sintetases (ONS) constitutivas, ONS I (ou nc-ONS) e ONS III (ou ec-ONS) presentes no sistema nervoso e endotélio vascular, respectivamente, e da ONS II (ou i-ONS), induzida pela endotoxina ou citocinas(13, 25).

O azul de metileno (AM) foi considerado e utilizado inicialmente, in vitro, como bloqueador seletivo da guanilato-ciclase em tecido muscular liso(7, 31).

Está claro atualmente que também inibe as ONS e inativa diretamente o ON(21). O pré-tratamento com glicocorticóides bloqueia a indução da ONS II nas células endoteliais, musculares lisas, macrófagos e fibroblastos(13, 19, 29). Também os glicocorticóides, de acordo com o tipo, concentração e biodisponibilidade, são potentes inibidores da expressão das citocinas, tanto ao nível de transcrição como após transcrição(1, 38).

Este estudo teve como objetivo avaliar, in vivo, o efeito do pré-tratamento com dexametasona (DEX) e com AM sobre o fenômeno de retardo do EG determinado pelo LPS em ratos.

MATERIAL E MÉTODOS Animais Foram utilizados ratos Wistar, machos,''specific patogen free'', com 8-10 semanas de vida, pesando entre 220-280 g, fornecidos pelo Biotério Central da Universidade Estadual de Campinas. Antes do estudo, os animais permaneceram pelo menos 2 semanas adaptando-se às condições do laboratório, com temperatura entre 22°C e 26°C, ritmo de luz e penumbra de 12/12 horas, recebendo ração (Labina, Purina) e água ad libitum. No planejamento e execução da pesquisa, foram obedecidas as recomendações do COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação Animal).

Drogas Foram utilizadas: LPS de E. coli, cepa 055:B5 (Sigma), na concentração de 50 mg/mL, solução de DEX (Decadron, Prodome) na concentração de 3 mg/mL e solução de AM (Sigma) na concentração de 2 mg/mL. Solução salina estéril e livre de pirogênio foi empregada como veículo na preparação das diluições. Em todos os estudos, os volumes do veículo e de cada solução administrada por via iv, utilizando uma das veias da cauda, para cada animal e para cada aplicação, foram equivalentes. A dose de LPS utilizada para o tratamento em todos estudos foi de 50 mg/kg de peso do animal.

Delineamento experimental Os estudos foram realizados entre 14 e 17 h do dia, após 24 horas de jejum alimentar, com os animais tendo livre acesso à água, suspenso no momento da prova.

Foram feitos três estudos do efeito da administração prévia da DEX (Figura_1).

Cada estudo foi formado de um grupo-controle (C) pré-tratado com salina e outro grupo em que o pré-tratamento foi feito com DEX. No primeiro estudo (E1h) foi utilizado DEX na dose de 6 mg/kg, o intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 1 hora e a avaliação do EG foi feita 1 hora após o tratamento. Nos segundo e terceiro estudos, empregou-se DEX 3 mg/kg. No segundo estudo, o intervalo de tempo entre o tratamento e a avaliação do EG foi de 2 horas (E2h) e no terceiro foi de 8 horas (E8h). Nestes dois últimos, o intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos. Em cada estudo, cada grupo foi formado de dois subgrupos de oito animais cada: o grupo- controle formado com o subgrupo CS, em que os animais receberam solução salina em duas oportunidades e com o subgrupo CLPS, em que, após administração de salina, os animais receberam LPS; o grupo pré-tratado com DEX formado com o subgrupo DEXS, em que os animais receberam DEX e, a seguir, solução salina; e com o subgrupo DEXLPS, em que, após administração da DEX, os animais receberam LPS. Após intervalo de 1, 2 e 8 horas do tratamento nos estudos E1h, E2h e E8h, respectivamente, foram feitas avaliações do EG.

Na observação do efeito do pré-tratamento com AM (2 mg/kg de peso), os animais foram também divididos em dois grupos: C pré-tratado com salina e outro grupo em que o pré-tratamento foi feito com AM. Cada grupo foi dividido em dois subgrupos de oito animais cada: o C, formado com subgrupo CS, em que os animais receberam salina em duas oportunidades e com o subgrupo CLPS, onde os animais receberam solução salina e, a seguir, LPS; o grupo pré-tratado com AM foi formado com o subgrupo AMS, em que os animais receberam salina após a administração de solução de AM e com o subgrupo AMLPS, onde os animais receberam LPS após administração do AM. O intervalo entre o pré-tratamento e o tratamento foi de 10 minutos. Uma hora após o tratamento, foi feita avaliação do EG (Figura_1).

Esvaziamento gástrico Como refeição de prova (RP) foi utilizada solução de NaCl 0,9% (p/v) marcada com fenol vermelho (6 mg/dL). Em todos os experimentos, a determinação do EG foi feita indiretamente, em ratos acordados, através da determinação da percentagem de retenção gástrica (RG) da RP, 10 minutos após sua administração orogástrica, utilizando técnica padronizada no laboratório(2, 5).

Análise estatística Na análise estatística foi empregada ANOVA, seguida, quando indicado, do teste de Tukey na comparação entre os pares. O valor de a foi estabelecido em 5%.

RESULTADOS Os resultados da RG são apresentados em média ± erro padrão da média (epm) nas Figuras_2, 3, 4, 5.

Nos animais pré-tratados com DEX ou AM e tratados com salina, os valores da RG não diferiram significativamente dos observados nos seus CS. Em todos os estudos, os animais pré-tratados com salina e tratados com LPS apresentaram valores da RG significativamente mais elevados que aqueles observados nos controles.

Constatou-se que em E1h e E2h (Figuras_2, 3), o pré-tratamento com DEX, mesmo com dose mais elevada ou até 2 horas após a administração do LPS, não interferiu no retardo do EG induzido pela endotoxina. Os valores da RG no subgrupo DEXLPS não diferiram significativamente dos observados no subgrupo que não recebeu DEX (subgrupo CLPS). No estudo E8h (Figura_4), o glicocorticóide reduziu significativamente a RG induzida pela endotoxina (DEXLPS vs CLPS) indicando bloqueio do efeito do LPS sobre o EG. O resultado no subgrupo DvLPS também não diferiu significativamente do observado no respectivo controle (subgrupo DEXS).

Na Figura_5, são apresentados os resultados da RG no estudo do efeito do AM.

Pode ser observado que administração prévia de AM reduziu significativamente a RG da refeição, nos animais tratados com endotoxina (AMLPS vs CLPS). A redução do efeito da endotoxina foi suficiente para que o subgrupo AMLPS não diferisse significativamente do seu controle (subgrupo AMS).

DISCUSSÃO Os sintomas como anorexia, náuseas, vômitos e saciedade precoce são manifestações comuns nos processos infecciosos. Acompanhando estes sintomas, tem sido observado retardo do EG que, em parte, pode explicá-los. A indução desta alteração funcional do estômago em animais, com o emprego do LPS, vem sendo utilizada como modelo de estudo dos mecanismos envolvidos no retardo do esvaziamento em infecções(8, 20). Contudo, até o momento, possivelmente em razão da complexidade do fenômeno, estes mecanismos não estão claramente definidos. Como fator adicional que dificulta o entendimento, destaca-se nos estudos disponíveis na literatura a falta de uniformidade quanto às doses de LPS, às vias de administração e ao momento em que foram feitas as observações in vivo ou in vitro, dificultando a comparação dos resultados.

É conhecido que a endotoxina estimula a síntese ou a liberação de várias citocinas da fase aguda da infecção ou injúria(4, 12, 18, 39). Recentemente, HERMANN et al.(17), estudando o efeito da endotoxina iv sobre o EG, após 60 minutos, concluíram que o fenômeno de retardo seria conseqüência da ação do fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) sobre o complexo dorsal do vago.

Observações indicam que a dexametasona liga-se preferentemente a receptores tipo II e suprimem o aparecimento do fator de necrose tumoral (TNF)(37, 38).

Entretanto, o efeito máximo de supressão foi demonstrado quando o intervalo entre a administração da dexametasona e o LPS foi de 5 horas(37). Sendo assim, como nos estudos E2h e E1h o pré-tratamento com o corticoesteróide foi feito 10 minutos e 1 hora antes do tratamento, respectivamente, o fenômeno poderia ser imputado à ação do TNF-a no sistema nervoso central (SNC), como sugerido por HERMANN et al.(17).

Contudo, há indicações de que a via aferente vagal é rota de atuação das citocinas no SNC(22). Como evidência da possibilidade de participação desta via, foi observado recentemente que a abolição da via sensitiva aferente do vago, com capsaicina, bloqueia o efeito da endotoxina sobre o EG de sólidos em ratos(6).

Em contradição com o que aqui foi encontrado, TURNER e BERRY(36), utilizando intervalos de tempos semelhantes, demonstraram em camundongos, utilizando cortisona, bloqueio do efeito no EG da administração intraperitonial de uma suspensão morta de S. typhimurium. Levando em conta a via de administração e a natureza do estímulo, é provável que esses tenham interferido num fenômeno diferente do aqui estudado.

Por outro lado, o pré-tratamento com AM diminuiu significativamente o efeito do LPS sobre EG, 1 hora após o tratamento. Como o AM bloqueia de forma não específica a geração e ação do ON(21, 27), este resultado sugere a participação, numa condição não-fisiológica, in vivo, deste gás no efeito da endotoxina sobre o esvaziamento. Numa primeira possibilidade, o ON seria gerado no sistema vascular, através da ativação da ONS III constitutiva. O LPS em doses extremamente elevadas via iv (mais de 200 vezes em relação à empregada neste estudo) determina agudamente, em ratos, hipotensão arterial sistêmica e diminuição da reatividade vascular aos vasoconstrictores. Este efeito é bloqueado com emprego de um antagonista de L-arginina, sugerindo a participação da ONS III(16, 34). Esta possibilidade, contudo, parece pouco provável, visto que a hipotensão arterial, em conseqüência à perda aguda de volume sangüíneo em ratos, aumenta o EG(14). Sendo assim, uma segunda possibilidade é que a geração do ON seja decorrente da atividade da ON-sintetase constitutiva ONS I, ativada via não-adrenérgica não-colinérgica.

Em adição, foi também observado no presente estudo, que a DEX foi capaz de inibir o efeito mais tardio da toxina (8 horas após), sugerindo que, nesta fase, há necessidade da indução de um sistema que envolva ativação ou síntese.

Sendo assim, estes resultados poderiam ser interpretados como devidos exclusivamente à supressão das citocinas pelo corticoesteróide, tendo como conseqüência a ausência de estímulo inibitório via vago e/ou circulatória do SNC. Contudo, a supressão mais efetiva das citocinas só foi conseguida com a administração crônica ou quando o intervalo entre a administração da DEX e o LPS foi de horas(26, 37).

Há muitas evidências que sugerem que este efeito tardio da DEX seria decorrente da supressão da produção de ONS II. Assim, o pré-tratamento com DEX bloqueia a expressão desta enzima no endotélio vascular de ratos tratados com endotoxina (19, 29). No estômago, foi demonstrada in vitro a indução desta enzima, utilizando preparações isoladas de fundo gástrico de ratos, incubadas durante 6 horas com LPS, indução esta bloqueada, acrescentando ao banho um inibidor de síntese protéica(32). Posteriormente, foi demonstrado o mesmo efeito in vivo empregando o pré-tratamento com aminoguanidina, inibidor específico da ONS II (33). Sendo assim, a liberação de ON nas células musculares lisas do estômago seria responsável pelo retardo do EG observado 8 horas após a administração do LPS. Outra possibilidade seria através da ativação da ONS II em macrófagos da submucosa gástrica, determinando o relaxamento da camada muscular circular adjacente, como já demonstrado in vitro(40). Como o estômago proximal, que inclui o fundo gástrico, participa do EG de líquidos(30), o efeito tardio do LPS, no presente estudo, poderia ser devido à liberação de ON neste segmento.

Recentemente, um estudo in vitro sugere que, adicionalmente, o LPS determinaria, pelo menos em parte, retardo do EG em conseqüência da inibição do relaxamento não-adrenérgico não-colinérgico e aumento da resposta à estimulação muscarínica do piloro(11).

Como conclusão, os resultados obtidos nesta pesquisa sugerem a possibilidade do envolvimento do óxido nítrico no retardo do EG produzido pelo LPS in vivo, inicialmente através da ativação da ON-síntetase constitutiva (ONS I) e, tardiamente, da induzida (ONS II).