Efeito protetor de antagonista das gliproteínas IIb/IIa nas alterações
hepáticas e pulmonares secundárias à isquemia e reperfusão do fígado em ratos
INTRODUÇÃO
A lesão de isquemia e reperfusão é a principal determinante da disfunção
hepática após hepatectomias, e também, a causa mais importante da disfunção
primária do enxerto hepático(2, 3, 23), além de ser a principal responsável
pelo retransplante nas primeiras duas semanas de pós-operatório(9).
Sabe-se que as plaquetas contribuem para lesão de isquemia e reperfusão no
coração(8), pulmão(20) e pâncreas(15). No fígado, o bloqueio da agregação
plaquetária também demonstrou efeito protetor na microcirculação(14).
As plaquetas carreiam várias moléculas de adesão necessárias às interações
intercelulares como a P-selectina, as integrinas e as glicoproteínas Ib e IIb/
IIIa(16). As glicoproteínas Ib são essenciais para a adesão plaquetária à
matriz subendotelial, formando ligações com o fator de Von Willebrand. As
glicoproteínas IIb/IIIa, através de ligações com o fibrinogênio, formam as
adesões entre as plaquetas, promovendo a agregação plaquetária(13).
Apesar de a agregação plaquetária ser mediada pelas diversas moléculas de
adesão, a etapa final é a ligação do fibrinogênio à plaqueta ativada, sendo o
complexo glicoprotéico de membrana IIb/IIIa o receptor do fibrinogênio(21, 22).
Assim, as glicoproteínas IIb/IIIa representam um alvo importante na supressão
da função plaquetária de agregação, com o benefício de minimizar os riscos de
sangramento, uma vez que o seu bloqueio não impede a adesão das plaquetas ao
endotélio lesionado.
O cloridrato de tirofiban é um antagonista de baixo peso molecular específico
para os receptores das glicoproteínas IIb/IIIa. O presente estudo teve o
objetivo de avaliar a ação do cloridrato de tirofiban na lesão de isquemia e
reperfusão do fígado, analisando as alterações hepáticas e pulmonares.
MÉTODOS
Foram utilizados ratos Wistar, com peso entre 200 e 250 g, criados no Biotério
Central da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP.
Todos os animais foram tratados segundo as Normas Internacionais de Proteção
aos Animais, sendo anestesiados com solução de cloridrato de cetamina e
cloridrato de xylasina na razão 4:1 (Ketalar® 50 mg.cm3/ Rompum®) administrada
pela via intraperitonial. Os ratos foram posicionados na mesa cirúrgica em
decúbito dorsal e imobilizados pelas quatro extremidades e pelo maxilar
superior. Foi realizada tricotomia da região abdominal, seguida de aplicação de
solução anti-séptica. A glote foi visualizada pela tração da língua, para fora
e para cima, e transluminescência da região (Figura 2). Um cateter (Jelco®)
número 14 adaptado foi utilizado como cânula orotraqueal. O ventilador mecânico
(Harvard inc., Holliston, MA, EUA) foi acoplado e ajustado para 60 incursões
ventilatórias por minuto com volume corrente de 0,08 mL por grama de peso. O
termômetro retal (YSI inc., Dayton, Ohio, EUA) foi posicionado e fixado.
Feita incisão mediana da pele e secção dos ligamentos hepáticos, a seguir
exposição do hilo, isolamento do pedículo comum aos lobos mediano e ântero-
lateral, e colocação de pinça microvascular atraumática. Constatada a mudança
de coloração dos lobos hepáticos isquêmicos, delimitando uma linha de transição
com a região do fígado não-isquêmica, procedeu-se, finalmente, ao fechamento da
parede abdominal em plano único para minimizar as perdas de calor e água. Os
animais foram submetidos a 1 hora de isquemia quente a partir do pinçamento do
pedículo(24). Durante esse período, os animais foram mantidos anestesiados, em
ventilação mecânica e sob controle da temperatura, mantida entre 36,5ºC e 37ºC.
Após 45 minutos de isquemia quente, foi injetado pela veia peniana dorsal 1 mL
de solução salina a 0,9% ou droga teste. Após 1 hora de isquemia quente, o rato
foi reoperado e a pinça vascular retirada cuidadosamente, finalizando-se o
período de isquemia e iniciando-se o período de reperfusão, que foi certificada
pela mudança da coloração.
Os ratos foram extubados após a retomada da ventilação espontânea e reflexo ao
estímulo doloroso em membros inferiores e posteriormente acondicionados em
gaiolas individuais com água ad libitum. Após 4 horas de reperfusão, os animais
foram novamente anestesiados utilizando-se 2 mL da solução anestésica
(cetamina/xylasina). Os ratos foram posicionados novamente na mesa cirúrgica, e
foi injetado 0,5 mL de azul de Evans pela veia peniana dorsal. Passados 15
minutos, realizou-se toracolaparotomia, punção cardíaca para coleta de 1 mL de
sangue e secção da veia cava inferior.
O fígado foi retirado para estudo histológico e da respiração mitocondrial. O
coração foi seccionado no ventrículo direito e passado um cateter de silicone
de 2,0 mm de diâmetro (Silastic, Dow Corning, nº 602.175) pelo tronco da
artéria pulmonar, e injetados 100 mL de solução salina 0,9% a 10 mL/minuto para
retirada do sangue intravascular. Os pulmões foram ressecados e encaminhados
para estudo da atividade tecidual da mieloperoxidase e da densidade óptica do
Azul de Evans.
Os animais foram divididos em 3 grupos: grupo 1 (G1) ' seis ratos foram
submetidos a laparotomia sem pinçamento do pedículo. Grupo 2 (G2) ' oito ratos
foram submetidos a isquemia e reperfusão, e receberam a administração
endovenosa de 1 mL de solução fisiológica 0,9%. Grupo 3 (G3) ' nove ratos foram
submetidos a isquemia e reperfusão e receberam a administração endovenosa de 1
mL de cloridrato de tirofiban (0,7 mg/kg). O cloridrato de tirofiban
(Agrastat®), apresentado em frasco-ampola com 12,5 mg e 50 mL, foi diluído em
soro fisiológico a 0,9%.
ESTUDOS REALIZADOS
Bioquímica (AST e ALT)
As aminotransferases foram utilizadas como marcador de lesão hepática.
Respiração mitocondrial
A função mitocondrial do fígado foi estudada segundo metodologia descrita
anteriormente(4). O consumo de oxigênio pela mitocôndria foi determinado
polarograficamente(7), usando um oxígrafo 5/6 (Gilson Medical Eletronics, Inc.)
com eletrodo de O2 (Clark,Yellow Springs Instruments Co.; Yellow Springs, Ohio,
EUA) a 28ºC. Para a determinação do estado 4 da respiração (estado basal) as
mitocôndrias receberam como substrato energético o succinato de potássio. O
estado 3 (S3) da respiração (estado ativo) foi induzido pela adição de
adenosina difosfato (ADP, Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri, EUA).
Após fosforilação completa de todo ADP adicionado para ATP, o estado 4 (S4) da
respiração foi medido novamente.
A relação de controle respiratório avalia o acoplamento das reações
mitocondriais pela razão de S3 com S4, ou seja, o consumo de oxigênio no estado
basal e ativo.
A razão do controle respiratório (RCR ' relação entre a velocidade de consumo
de oxigênio na presença de ADP e a velocidade obtida após o gasto final de ADP)
e a relação ADP/O foram calculadas como índices das funções oxidativas e
fosforilativas das mitocôndrias(2).
A relação ADP/O representa a razão de ADP utilizado para fosforilação sobre o
oxigênio consumido na reação, ou seja, o quanto de oxigênio foi gasto na
fosforilação.
O estado 3 (S3) e o estado 4 (S4) da respiração foram expressos em ng de átomos
de oxigênio por miligrama de proteína mitocondrial por minuto determinada pelo
método de LOWRY et al.(17).
Estudo histológico
As alterações histológicas foram avaliadas por um patologista, sem que o mesmo
tivesse conhecimento dos grupos estudados. O material foi fixado em solução de
formol a 2% e corado com hematoxilina-eosina. Foram analisados os achados
referentes às alterações da microvasculatura, infiltração leucocitária portal,
necrose hepatocelular e hiperplasia das células de Kupfer.
Permeabilidade vascular com azul de Evans
O azul de Evans é um corante que, quando injetado por via intravenosa, tem
grande afinidade pela albumina. Essa característica permitiu utilizá-lo como
método para avaliar permeabilidade vascular, uma vez que sua concentração no
tecido pulmonar lavado é maior quanto maior for o extravasamento da albumina
pelo endotélio lesado. O corante foi administrado 15 minutos antes do
sacrifício e foi avaliado como descrito por JANCAR et al.(11).
Dosagem de mieloperoxidase (MPO)
A atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) foi utilizada como indicativo da
quantidade de neutrófilos no pulmão. As amostras foram armazenadas em
nitrogênio líquido. No dia do ensaio para cada mg de peso do tecido foram
adicionados 3 µL de tampão de homogeneização. Os tecidos foram homogeneizados,
submetidos ao ultra-som (40Hz) e centrifugados a 3000 g por 30 min a 4ºC.
Misturou-se 10 µL de cada amostra, 700 µL de PBS contendo 0,25% de soro
albumina bovina, 500 µL de tampão fosfato 0,1 M, 100 µL de solução orto-
dianisidina e 100 µL de solução de azida sódica a 1%. Uma alíquota de 150 µL de
cada amostra foi colocada em uma placa de 96 poços e a densidade óptica (DO)
determinada com a utilização de filtro de 490 nm. Os resultados foram expressos
em DO a 490 nm.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram expressos como média dos valores e desvio padrão da média
(DP). Para a análise dos achados histológicos foi utilizado teste de Kruskal-
Wallis. Quando houve diferença estatística foi aplicado o teste de Mann-Whitney
para análise dois a dois. Para determinar a significância dos demais resultados
foi utilizada análise de variância (ANOVA) para análise entre os grupos e
Newman-Keuls para análise entre dois grupos. O valor de P <0,05 foi considerado
significante.
RESULTADOS
As repercussões locais do fenômeno de isquemia e reperfusão foram avaliadas
segundo alterações observadas no fígado. Foram analisadas as dosagens séricas
de aminotransferases, a função mitocondrial e avaliação histológica.
Aminotransferases
Os níveis séricos de AST e de ALT elevaram-se significativamente no G2,
submetido a lesão de isquemia e reperfusão sem droga, quando comparados aos do
grupo controle (P <0,001). No G3, submetido a lesão de isquemia e reperfusão
com a utilização do cloridrato de tirofiban, também houve elevação de
aminotransferases (Tabela_1). No entanto, estes valores foram
significativamente menores que os encontrados no G2 (P <0,05).
Respiração mitocondrial
Foram analisados os valores obtidos no estado basal (S4) e estado ativo (S3), e
das relações RCR e ADP/O, que são indicadores das funções oxidativas e
fosforilativas das mitocôndrias.
A relação RCR apresentou redução significativa no G2, submetido a isquemia sem
tratamento, quando comparado ao G1, submetido a laparotomia apenas (P <0,001).
No G3, tratado com cloridrato de tirofiban, houve elevação significativa do
RCR, quando comparado ao G2 (P <0,001) (Tabela_2).
A relação ADP/O foi significativamente menor (P <0,001) no grupo submetido a
isquemia e sem tratamento quando comparado ao controle. Após tratamento com
cloridrato de tirofiban (G3), a relação ADP/O apresentou elevação significativa
(P <0,001), aproximando-se dos valores encontrados no grupo controle (Tabela
3).
Estudo histológico
O grupo tratado com tirofiban apresentou achados de necrose, infiltrado
inflamatório, hemorragia e microesteatose, sendo avaliados em menor proporção
(P <0,05) que o grupo de isquemia não tratado (G2) (Figura_1).
Avaliação pulmonar
O estudo da densidade óptica do corante no parênquima pulmonar evidenciou
elevação significativa nos valores obtidos no grupo submetido apenas a isquemia
e reperfusão - G2 - quando comparado ao G1, submetido a laparotomia apenas (P
<0,01). No grupo tratado com cloridrato de tirofiban, a densidade óptica do
corante apresentou redução significativa (P <0,01), não sendo constatada
diferença significativa com o G1 (Tabela_4).
Mieloperoxidase
O estudo da atividade da mieloperoxidase no parênquima pulmonar não demonstrou
diferença significativa entre o grupo controle e o grupo submetido a isquemia e
reperfusão, sem tratamento (G2). O G3 apresentou aumento significativo da
atividade da mieloperoxidase no parênquima pulmonar (Tabela_5).
DISCUSSÃO
A lesão de isquemia e reperfusão hepática é comumente encontrada em uma
variedade de condições clínicas como o transplante hepático, hepatectomias(3,
18, 19, 24) e estados pós-choque. A importância dada a esse fenômeno é cada vez
maior, especialmente no transplante hepático. Atualmente, a lesão de isquemia e
reperfusão é a principal variável responsável pelos resultados precoces do
transplante hepático.
A participação das plaquetas na lesão de isquemia e reperfusão tem papel
destacado(14). Esta participação na fisiopatogenia da lesão de isquemia e
reperfusão do coração(8), pulmão(20) e pâncreas(15) está bem estabelecida. No
fígado, CYWES et al.(5, 6) demonstraram, em trabalhos clínico e experimental,
que a lesão de reperfusão hepática se correlaciona diretamente com a ativação
das plaquetas.
Os efeitos do cloridrato de tirofiban na lesão de isquemia e reperfusão
hepática foram avaliados utilizando-se os níveis séricos das aminotransferases,
a análise da função mitocondrial e exame histológico do fígado. O teste de azul
de Evans e dosagem tecidual de mieloperoxidase foram empregados para o estudo
dos efeitos pulmonares.
Encontrou-se lesão hepatocelular importante no grupo G2, submetido a isquemia e
reperfusão sem tratamento, que apresentou níveis séricos de aminotransferases
significativamente superiores ao grupo G1. Com o uso do cloridrato de
tirofiban, o G3 apresentou níveis de aminotransferases significativamente
inferiores ao G2, o que denota efeito protetor da droga na lesão de isquemia e
reperfusão.
A avaliação da função mitocondrial é estudo mais sensível que os exames
laboratoriais. A mitocôndria é a principal organela da respiração celular e
oferece o substrato energético das células, a adenosina trifosfato (ATP).
Portanto, o funcionamento adequado dessa organela é fundamental para a
viabilidade do tecido e por este motivo é utilizado em diversos modelos
experimentais.
Em recente revisão, JASSEM et al.(12) discutiram o papel da mitocôndria na
lesão de isquemia e reperfusão. Esses autores ressaltaram a importância da
mitocôndria no estresse oxidativo, grande responsável pela lesão tecidual aguda
(1, 10, 25).
O presente estudo mostrou redução significativa dos valores do estado ativo
(S3) no grupo de ratos submetidos a isquemia e reperfusão quando comparados ao
grupo controle. Essa diminuição reflete a redução da capacidade de utilização
do oxigênio para produzir ATP a partir do ADP. No grupo tratado com cloridrato
de tirofiban, os valores de S3 se elevaram, demonstrando efeito protetor desta
droga sobre a função de fosforilação mitocondrial. No estado basal (S4), por
sua vez, não houve variações significativas nos três grupos estudados. O
aumento do consumo de oxigênio em S4 e a ausência de resposta ao estímulo com
ADP, estão associados ao desacoplamento da oxidação e fosforilação
mitocondrial. Uma vez desacoplada, a mitocôndria consome oxigênio de forma
independente em níveis basais superiores aos normais. O desacoplamento é
processo irreversível e letal. Como não houve diferenças significativas entre
os três grupos, conclui-se que o modelo utilizado produz lesão celular
significativa, contudo, reversível.
A lesão de isquemia e reperfusão leva a uma série de alterações relacionadas à
falta de aporte de nutrientes para as células, seguida de resposta inflamatória
desencadeada pelo restabelecimento da circulação(10). Na microcirculação, uma
série de eventos leva à agregação plaquetária, migração dos leucócitos para o
interstício, liberação de radicais livres de oxigênio e lesão tecidual. Essa
agressão pode levar a lesões irreversíveis do tecido ou a alterações ultra-
estruturais que modificam o funcionamento normal da célula, sem,
necessariamente, causar danos letais. Assim, a perda do metabolismo normal dos
hepatócitos leva a acúmulo intracelular de lípides e a perda da função da bomba
de sódio-ATP possibilita a passagem de água para o meio intracelular, levando à
tumefação dos hepatócitos(12). Esses hepatócitos vacuolizados e tumefeitos
favorecem o aumento da resistência portal intra-hepática, isquemia e,
conseqüentemente, lesão tecidual(1). O grupo de ratos submetidos a isquemia e
reperfusão (G2) apresentou redução significativa da capacidade de fosforilação
das mitocôndrias dos hepatócitos, quando comparado ao grupo controle (G1). O
cloridrato de tirofiban demonstrou melhora significante no consumo da ADP,
formando mais moléculas do substrato energético celular, ATP. Dessa forma, o
estudo da função da ultra-estrutura celular responsável pelo fornecimento
energético indispensável à viabilidade dos hepatócitos mostrou que o
antagonista da glicoproteína IIb/IIIa teve efeito protetor neste modelo
experimental.
Os resultados do presente estudo demonstraram aumento significativo na
intensidade de necrose, infiltrado de células inflamatórias, microesteatose e
hemorragia sinusoidal no grupo de ratos submetido a isquemia e reperfusão. No
grupo tratado com cloridrato de tirofiban, essas variáveis apresentaram
diminuição significativa da intensidade, o que, mais uma vez, demonstra efeito
protetor para a lesão de isquemia e reperfusão.
As repercussões da lesão de isquemia e reperfusão hepática não se restringem ao
fígado, uma vez que o estado pró-inflamatório resultante da reperfusão é capaz
de alterar outros órgãos não submetidos a lesão isquêmica. Um dos órgãos mais
afetados é o pulmão, que por sua vez, tem grande impacto na sobrevida do doente
(20). O teste com azul de Evans é indicador da permeabilidade vascular. A alta
afinidade do contraste com a albumina possibilita quantificar a lesão
endotelial pela densidade óptica do tecido. Os resultados obtidos no presente
trabalho, demonstraram alteração significativa da permeabilidade vascular dos
pulmões dos ratos submetidos a isquemia e reperfusão do fígado. O uso do
antagonista da glicoproteína IIb-IIIa, cloridrato de tirofiban, evitou a lesão
endotelial da microcirculação pulmonar, demonstrando o seu efeito protetor na
lesão de reperfusão em órgãos à distância. Esses dados também sugerem que as
plaquetas têm um papel importante na fisiopatogenia da lesão de reperfusão.
Contudo, como demonstrado nos resultados da atividade da mieloperoxidase no
tecido pulmonar do grupo tratado com cloridrato de tirofiban, o aumento
significativo da sua atividade comprova que existe uma relação intercelular
importante entre as plaquetas e os leucócitos, e que estes não são os únicos
responsáveis pela lesão pulmonar de reperfusão.
Concluiu-se que o uso do cloridrato de tirofiban exerceu papel protetor da
lesão hepática de isquemia e reperfusão, com melhora dos parâmetros
histológicos, bioquímicos e da respiração mitocondrial dos hepatócitos e impede
o aumento da permeabilidade vascular secundária à lesão de reperfusão hepática.
