Estabelecimento e multiplicação in vitro de Prunus sp. em diferentes meios de
cultivo
Estabelecimento e multiplicação in vitro de Prunus sp. em diferentes meios de
cultivo 1
Establishment and multiplication in vitro of Prunus sp. in different culture
media
Alexandre Couto RodriguesI; Carlos Augusto Posser SilveiraII; Gérson Renan de
Luces FortesIII; José Carlos FachinelloIV; João Baptista da SilvaV
IEngº Agrº, Dr., CNPq, e-mail: rcale@ufpel.tche.br
IIEngº Agrº, M.Sc., FAEM/UFPel
IIIEngº Agrº, Dr., Embrapa Clima Temperado; e-mail: gerson@cpact.embrapa.br;
Cx. Postal 403, Pelotas/RS
IVEngº Agrº, Dr., Prof. Titular FAEM/UFPel
V Engº Agrº, Livre Docente, Dr., Prof. Titular IFM/UFPel
INTRODUÇÃO
O uso de mudas com qualidade sanitária e genética é de fundamental importância
na implantação de um pomar comercial. No Sul do Brasil, os porta-enxertos de
frutíferas de caroço são propagados por sementes. Porém, nem sempre se
conseguem sementes em quantidade e qualidade para satisfazer as necessidades.
Portanto, para atender a essa demanda, é interessante o uso da micropropagação.
Esta técnica envolve o uso de diferentes meios de cultura que variam de acordo
com a espécie, com a cultivar que se deseja trabalhar e, também com o estádio
de desenvolvimento da planta (Grattapaglia & Machado, 1998). Com o gênero
Prunus, vários trabalhos, com os mais diferentes objetivos, têm sido realizados
nos últimos anos (Theriou, 1998; Loreti & Massai, 1995; Morini et
al.,1990). Theriou (1998), utilizou o meio MS para a multiplicação do porta-
enxerto Mr.S 2/5, com adição de cloreto de sódio (NaCl2) ou cloreto de cálcio
(CaCl2) ao meio, e concluiu que a presença desses sais incrementa a produção in
vitro. Morini et al. (1990), também testaram o meio MS para a multiplicação dos
porta-enxertos Mr.S 2/5 e GF 677, obtendo bons resultados. Apesar disso, esta
técnica, quando aplicada em espécies do gênero Prunus, apresenta alguns
problemas, tais como oxidação e contaminação dos explantes durante a fase de
estabelecimento e também pequena taxa de desenvolvimento durante a fase de
multiplicação, necessitando mais estudos. O presente trabalho teve por objetivo
avaliar o estabelecimento e a multiplicação de cultivares de Prunus sp., em
diferentes meios de cultura.
MATERIAL E MÉTODOS
O trabalho foi realizado no Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Clima
Temperado, Pelotas-RS.
Experimento I: Fase de estabelecimento
As cultivares estudadas na fase de estabelecimento in vitro foram os porta-
enxertos: Marianna Comum, GF677, Aldrighi, Okinawa, Nemaguard, Mirabolano e as
cultivares-copa: Eldorado, Diamante e Santa Rosa. Os meios de cultura MS
(Murashige & Skoog, 1962), MS ¾, V (Villegas et al., 1992) e SH (Schenck
& Hildebrandt, 1972) foram utilizados para o estabelecimento dos explantes.
Aos sais de macro e micronutrientes e vitaminas dos meios citados, foram
adicionados AIB (0,01 mg.L-1) e BAP (0,7 mg.L-1). Os meios foram acrescidos de
sacarose (30 g.L-1), ágar (6,5 g.L-1), mioinositol (100 mg.L-1), ácido
ascórbico (10 mg.L-1), tiamina (1,0 mg.L-1) e o pH foi ajustado para 5,8.
Os ramos das diferentes cultivares foram pulverizados a cada dois dias com
Benomil (1,0 mg.L-1) e Agrimicina (2,4 mg.L-1), por duas semanas, para a
desinfestação dos mesmos. Na coleta das brotações terminais (dezembro), as
plantas estavam em desenvolvimento vegetativo. No laboratório, fez-se a
desinfestação com álcool etílico 70% por 10 segundos, seguida de tratamento em
solução de hipoclorito de sódio a 1,5%, adicionada de uma gota de tween, onde
os ramos permaneceram imersos durante 15 a 20 minutos. Os segmentos nodais
foram cortados com 1,0 cm de comprimento e individualizados em tubos de ensaio,
com 10 ml de meio de cultura. Os segmentos nodais foram cultivados in vitro,
sob luz fluorescente com radiação de 20 mE.m-2.s-1, fotoperíodo de 16 horas e
temperatura de 25±2ºC.
Nesta fase, avaliaram-se, após 35 dias, a percentagem de estabelecimento (% de
explantes que brotaram isentos de patógenos), contaminação e oxidação das
cultivares estudadas. O delineamento experimental adotado foi o de blocos
casualizados, com nove tratamentos e três repetições, sendo cada repetição
constituída de cinco segmentos nodais. A comparação entre as médias dos
tratamentos foi realizada pelo teste de Duncan (a=0,05).
Experimento II: Fase de multiplicação
Na primeira fase de multiplicação, testaram-se os meios SH e MS ¾, com as
mesmas concentrações hormonais, vitaminas, ágar, açúcar e pH citados no
estabelecimento. Utilizaram-se brotações inferiores a 0,5 cm de comprimento.
Após 35 dias, avaliaram-se a taxa de multiplicação, calculada através da
diferença entre o número final e o número inicial de gemas, dividido pelo
número final multiplicado por 100; a percentagem de crescimento calculada pelo
comprimento final e o inicial (medido com régua), expresso em percentagem, e o
número de brotações obtido pela média do número final de brotações. As
cultivares dos porta-enxertos em estudo foram: Mr.S 2/5, Mirabolano, Hansen
2168, Marianna Comum, Hansen 536, Okinawa, GF 677, Aldrighi e a cultivar copa
Eldorado.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, com o
experimento fatorial A (9 cultivares) x B (2 meios de cultivo), com três
repetições. Cada repetição constou de um frasco de 250 ml, com 30 ml de meio e
quatro explantes. A comparação entre as médias dos tratamentos foi realizada
pelo teste de Duncan (a=0,05).
Experimento III: Fase de multiplicação
Na segunda multiplicação, após 35 dias, avaliaram-se as mesmas variáveis
citadas no experimento II. As cultivares dos porta-enxertos em estudo foram:
Marianna Comum, Mirabolano, Mr.S 2/5 e GF 677. Utilizou-se o meio MS 3/4 com
diferentes concentrações de ágar (4,5; 5,5; 6,5 g.L-1), adicionado de AIB (0,05
mg.L-1), BAP (0,6 mg.L-1) e AG3(0,2 mg.L-1). O experimento foi um fatorial com
quatro cultivares e três concentrações de ágar, sendo o delineamento
inteiramente casualizado, com três repetições. As médias foram comparadas pelo
teste de Duncan (a=0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Experimento I: Os resultados do estabelecimento das cultivares podem ser
observados na Figura_1. Esses resultados foram superiores àqueles obtidos por
Rodrigues et al. (1999) que estabeleceram in vitro os porta-enxertos GF 677,
Marianna Comum e Mirabolano. Essas diferenças podem ser atribuídas à época de
coleta do material propagativo. As altas percentagens agora obtidas devem-se ao
estado fisiológico da planta que, na época em que o material foi coletado
(verão), se encontravam em pleno desenvolvimento vegetativo, enquanto, no
trabalho desenvolvido por Rodrigues et al. (1999), as plantas de onde foram
coletados os explantes, encontravam-se em início de dormência (outono). Esse
fato provavelmente dificultou a circulação da seiva e de produtos sistêmicos,
impedindo a desinfecção dos tecidos. Em função do que foi exposto, é importante
observar a influência da época de coleta dos explantes sobre a capacidade de
estabelecimento dos mesmos. Observou-se ainda que a maior percentagem de
estabelecimento ocorreu no meio MS ¾, não diferindo dos meios SH e MS (Figura
2). O meio Villegas proporcionou a menor percentagem de estabelecimento e
número de explantes oxidados (Figura_2 e Tabela_2). Esse meio apresenta menor
concentração de sais que os demais meios testados, o que influenciou na menor
oxidação dos explantes.
As cultivares Mirabolano, Okinawa, Nemaguard, Diamante e Aldrighi apresentaram
maior percentagem de contaminação, enquanto a cultivar Santa Rosa teve maior
percentual de oxidação que as demais (Tabela_1). Segundo Rodrigues (2000), a
cultivar Santa Rosa apresenta altas concentrações de compostos fenólicos
totais. Os diferentes tipos de fenóis presentes nos tecidos, ao entrarem em
contato com o oxigênio, sofrem reações de oxidação, cujos produtos resultantes
são tóxicos, causando escurecimento e necrose do tecido vegetal. O uso de
substâncias antioxidantes, tais como ácido ascórbico, PVP
(polivinilpirrolidona), ácido cítrico e DIECA (dietilditiocarbamato), tem
propiciado bons resultados no controle da oxidação no cultivo in vitro. Quanto
à variação da percentagem de contaminação, no estabelecimento in vitro das
diferentes cultivares em estudo, atribui-se às condições fitossanitárias do
material vegetal coletado, visto que as plantas são mantidas em pomares e não
sob condições controladas (telados e casas de vegetação).
Experimento II: Em relação aos experimentos, na primeira fase de multiplicação,
observou-se que o meio MS ¾ foi melhor do que o SH nas três variáveis (Tabela
3). O porta-enxerto Mr.S 2/5 apresentou a maior taxa de multiplicação,
diferindo dos demais (Tabela_3), confirmando a performance deste porta-enxerto
cultivado in vitro, conforme mostraram Theriou (1998) e Morini et al. (1990).
Para as variáveis número de brotações e percentagem de crescimento, as
cultivares Mirabolano e Mr.S 2/5 destacaram-se das demais (Tabela_3).
Experimento III: Na segunda fase de multiplicação, em que se avaliaram
diferentes concentrações de ágar no meio MS ¾, observou-se que a concentração
de 5,5 g.L-1 propiciou maiores percentagens de crescimento, taxa de
multiplicação e número de brotações (Tabela_4). Além dos diferentes meios
básicos e fitorreguladores utilizados, a concentração de ágar também pode
influenciar no cultivo in vitro. O ágar pode ser tóxico para algumas espécies,
principalmente quando apresenta baixo grau de pureza (Caldas et al., 1990). Os
explantes de Marianna Comum cresceram mais do que aqueles das cultivares
Mirabolano e Mr.S 2/5, enquanto 'Mirabolano' apresentou maior taxa de
multiplicação e número de brotações (Tabela_4). As percentagens de crescimento
foram maiores do que as do primeiro experimento de multiplicação devido à
utilização de AG3 (0,2 mg.L-1) e maior concentração de AIB (0,05 mg.L-1).
CONCLUSÕES
1) O meio Villegas proporciona menor percentual de oxidação dos explantes
durante o período de estabelecimento in vitro.
2) Com o meio MS ¾, verificou-se maior percentagem de estabelecimento dos
explantes de diferentes espécies do gênero Prunus.
3) Na multiplicação, o meio MS ¾, contendo 5,5 g.L-1 de ágar, proporciona os
melhores resultados para todas as variáveis estudadas.
