SEGREGAÇÃO NATURAL DE VIRÓIDES DOS CITROS DETECTADA NA INDEXAÇÃO BIOLÓGICA E
BIOQUÍMICA E CONFIRMADA PELOS SINTOMAS DE PLANTAS DE CAMPO
COMUNICAÇÃO CIENTÍFICA
A presença de doença em plantas cítricas pode ser detectada através da
indexação ou testes biológicos, procedimento que consiste na união dos tecidos
pela enxertia de um hospedeiro suspeito numa planta indicadora sensível; no
caso de estas plantas sensíveis inoculadas deixarem de exibir sintomas, tem-se
a indicação da ausência do viróide do material testado (Olson, 1968).
Atualmente, de forma conjunta, paralela ou alternativa, se faz também a
indexação por métodos bioquímicos e de biologia molecular (Roistacher, 1991).
As indexações biológicas e bioquímicas são fundamentais para qualquer programa
de melhora sanitária e de certificação de citros quando se pensa no estudo da
utilização de viróides como agentes ananicantes, visando ao estabelecimento de
pomares de alta densidade, isto para se comprovar a contaminação e avaliar a
eficiência dos métodos de inoculação (Stuchi, 1993; Stuchi et al., 1998;
Roistacher, 1994).
Os viróides dos citros apresentam distribuição irregular. Há relatos, nos quais
só se conseguiu detectá-los em um dos oitos setores de uma planta contaminada
(Roistacher, 1991); por isso, esse autor recomenda que, para indexação de
rotina, pelo menos quatro varetas devem ser coletadas, uma em cada quadrante da
planta e, para reindexação de bloco de matrizes, devem ser coletadas oito
varetas ao redor da planta. Fernandes (1983), estudando a distribuição do
viróide da exocorte em diferentes órgãos da laranjeira-'Baía' (Citrus sinensisL
Osbeck) sobre cinco diferentes porta-enxertos, confirmou que o viróide é
sistêmico, mas está distribuído em todos os órgãos da planta cítrica de uma
maneira irregular. Corrales-Giraldo (1990) afirmou que: "As estirpes do
viróide da exocorte estão distribuídas na parte aérea dos limoeiros de maneira
irregular não obedecendo a nenhum tipo de distribuição específica e que, numa
planta de limão-'Tahiti' clone 'Quebra-Galho', podem existir áreas com estirpes
fortes, severas, moderadas ou fracas do patógeno e mesmo partes completamente
livres do viróide. Todavia, os dados sugerem que, na parte Norte-Alta, se
encontram as estirpes mais severas, enquanto, na parte Sul-Baixa, estão as mais
fracas". Salibe (1961) afirmou ser possível a obtenção de borbulhas livres
de exocorte, a partir de árvores contaminadas, através de enxertias sucessivas.
Objetivou-se, com o presente trabalho, estudar a relação entre os resultados da
indexação biológica e bioquímica de viróides com o comportamento no campo de
plantas inoculadas com diferentes isolados empregados como agentes ananicantes
para pomeleiro 'Marsh Seedless' sobre Poncirus trifoliata, durante a qual foi
observada uma segregação natural destes patógenos.
Selecionaram-se cinco plantas existentes no Centro de Citricultura "Sylvio
Moreira" em função dos sintomas de exocorte que apresentavam. Cada uma
dessas plantas constituiu-se num isolado. Esses isolados apresentavam as
seguintes características: Isolado 1 - Origem: laranjeira-'Hamlin' (clone
velho) enxertada em citrangeiro 'Troyer', do ensaio de comparação entre clones
velhos e clones novos (nucelares), plantado em 1955; Isolado 2 - Origem:
laranjeira-'Baianinha' (clone velho) enxertada em limoeiro-'Cravo', do ensaio
de comparação entre clones velhos e clones novos (nucelares), plantado em 1955;
Isolado 3 - Origem: laranjeira-'Hamlin' (clone velho) enxertada em laranjeira-
'Caipira', tratamento 7 (exocorte forte) do ensaio de melhoramento de
laranjeira-'Hamlin', plantado em 1962; Isolado 4 - Origem: laranjeira-'Hamlin'
(clone velho) enxertada em laranjeira-'Caipira', tratamento 5 (exocorte fraca)
do ensaio de melhoramento de laranja-'Hamlin', plantado em 1962; Isolado 5 -
Origem: laranjeira-'Hamlin' (clone velho) enxertada em limoeiro-'Cravo' com
características de nanismo nas árvores de campo sem apresentar sintomas
clássicos da exocorte, do ensaio de comparação entre clones velhos e clones
novos (nucelares), plantado em 1982.
Anteriormente, mudas sadias de pomeleiro 'Marsh Seedless'(Citrus paradisi
Macf.) enxertadas sobre Poncirus trifoliata foram plantadas no campo, em
janeiro de 1991, com espaçamento de 7 m entre linhas e 3 m entre plantas e
conduzidas de acordo com os tratos culturais habituais e sem irrigação. A
inoculação dos diferentes isolados, nas plantas de pomeleiro a campo, foi
realizada no campo, seis meses após o plantio (julho de 1991), através de
enxertia de duas borbulhas em cada planta, sendo uma no tronco da copa e outra
no tronco do cavalo; após o pegamento, as gemas tiveram seu desenvolvimento
impedido pela retirada dos brotos. Os tratamentos do experimento foram os
seguintes: inoculação dos isolados 1 a 5 (tratamentos 1 a 5), e uma testemunha,
o tratamento 6. Cada parcela era constituída de duas plantas inoculadas com o
mesmo isolado, exceto o tratamento-testemunha que não recebeu inoculação. Foram
empregadas cinco repetições com delineamento em blocos casualizados.
Realizou-se a indexação de todas as plantas do experimento, utilizando-se, como
plantas indicadoras, mudas de cidreira 'Etrog 861-S-1 enxertada sobre limoeiro-
'Cravo' em 05-01-1995. Foram coletadas varetas de cada árvore de campo de
pomeleiro, seguindo-se o esquema de casualização proposto por Greve et al.
(1991). Para cada árvore de campo inoculada com cada uma das fontes, em julho
de 1991, havia uma planta de cidreira correspondente na casa de vegetação, como
planta indicadora. Paralelamente, as árvores de pomeleiro sobre P.trifoliata
(inóculo) foram examinadas para a constatação da presença de sintomas da
exocorte no tronco do porta-enxerto e tiveram suas alturas e diâmetros medidos
para avaliar o grau de redução no seu tamanho. Repetiu-se, para a indexação, o
delineamento do experimento de campo, com as parcelas em casa de vegetação
(cidreira), recebendo a mesma denominação das parcelas de campo (pomeleiro). A
leitura deu-se cinco meses após a inoculação, quando foram atribuídas notas
para os sintomas de exocorte em cidreira. As notas foram atribuídas conforme a
seguinte escala: 0 = sem sintomas; 1= sintoma fraco; 2 = sintoma intermediário;
3 = sintoma forte. Estes procedimentos se basearam nas recomendações de Müller
& Costa (1991). Posteriormente, foram coletados 10 g de ápices de cada uma
das 60 plantas de cidreira empregadas no teste. Estas amostras foram
liofilizadas e enviadas ao Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias,
Valência (IVIA), Espanha, onde se procedeu à caracterização bioquímica (s-PAGE)
de cada um dos isolados, segundo a metodologia descrita por Duran-Vila (1986).
A virulência dos isolados em cidra Etrog 861 S1, após a inoculação com os
diferentes isolados, apresentou diferenças significativas (Tabela_1). Os
isolados 1; 2 e 3 apresentaram sintomas em cidra entre intermediários e fortes,
enquanto os isolados 4 e 5 e a testemunha não mostraram sintomas. Os resultados
expressos na Tabela_1, referentes à classificação dos sintomas em cidra,
indicaram a presença de CEV (CEV- citrus exocortis viroid) nos isolados 1; 2 e
3, bem como a ocorrência de um viróide, ou uma mescla de viróides distintos de
CEV, no isolado 4, enquanto o isolado 5 e a testemunha estariam livres de
viróides.
Os resultados das análises dos viróides presentes nos isolados por sPAGE,
expressos na Tabela_1, confirmam a indicação ao mostrarem a presença do viróide
da exocorte dos citros nos isolados 1; 2 e 3, associado a outros dois viróides,
CV-II e CV- III. O isolado 4 não contém CEV, mas possui CV- II e CV-III. Já o
isolado 5 está livre de viróides. Os isolados 1 a 4 causaram redução no porte
das plantas (Tabela_1). Essa redução foi , aproximadamente, de 25; 21; 4 e 18%
na altura das plantas, para os isolados 1; 2; 3 e 4, respectivamente. Para o
diâmetro da copa, a redução foi de 16; 17; 22 e 16%, para os isolados 1; 2; 3 e
4, respectivamente. Os resultados obtidos mostram claramente que a inoculação
feita no campo, aos seis meses do plantio, com uma borbulha no porta-enxerto e
outra na copa, é suficiente para se conseguir redução significativa no
desenvolvimento vegetativo.
Os resultados das análises do conteúdo em viróides das diversas fontes por
sPAGE, expressos na Tabela_2, confirmam a indicação ao mostrarem a presença do
viróide da exocorte dos citros (CEV- citrus exocortis viroid) nas fontes 1; 2 e
3, associado a outros dois viróides, CV-II e CV- III. A fonte 4 não contém CEV,
mas possui CV- II e CV-III. Já a fonte 5 está livre de viróides. A fonte 4,
apesar de conter [CV-II + CV-III], não mostrou sintomas de anelamento do
pecíolo e epinastia fraca, devida ao anelamento do pecíolo, conforme descrito
por Duran-Vila et al. (1993). Tal fato se deve a que cidras inoculadas por
viróides dos grupos CV ¾ II e CV ¾ III só desenvolvem sintomas foliares após a
realização da segunda desfolha e transferência para câmara de crescimento
(Rodrigues et al., 1999).
Nas parcelas 1 D1, 2 B, 1 E, e 2 A, houve segregação de viróides, sendo que,
nas duas primeiras, o CEV não está presente e, nas duas últimas, não foi
detectada a presença de CV-II. Hadas et al. (1989) relataram a ocorrência de
fenômeno semelhante quando a fonte de viróides usada nos testes biológicos foi
pomeleiro 'Marsh Seedless'. Como conseqüência desta segregação, não ocorreram
sintomas em cidra nas parcelas 1 D1 e 2 B, o que ocorreu nas parcelas 1 E e 2
A, indicando que é necessária a presença de CEV para a manifestação de sintomas
típicos de exocorte em cidra.
Na parcela 2 D2 de cidreira, não se detectaram viróides, provavelmente, devido
à ausência dos mesmos no material de inoculação do teste biológico (escape), já
que a planta de pomeleiro inoculada no campo, que forneceu o inóculo para a
indexação, teve desenvolvimento vegetativo normal e ausência de sintomas no
tronco.
Quanto à parcela 3 C2 de cidreira , o que ocorreu foi uma segregação drástica,
não relatada na literatura consultada , já que a planta de campo inoculada e
fornecedora de inóculo mostrou redução de porte semelhante às plantas
inoculadas com CEV e sintomas no tronco típicos de exocorte. Em todos os casos,
as varetas para indexação foram coletadas de diferentes setores das plantas e
casualizadas de acordo com o proposto por Greve et al. (1991), que propoem,
inclusive, coleta de um número maior de varetas, quando comparado com as
recomendações de Roistacher (1991).
O isolado 4, por causar redução no porte das plantas, sem a ocorrência de
sintomas expressivos no tronco e com maior enfolhamento, deve ser o empregado
em estudos de redução do porte das plantas cítricas.
1 - É necessária a presença do viróide da exocorte para a manifestação dos
sintomas típicos em cidra durante a indexação biológica-padrão no Brasil, mesmo
quando ocorre infeção com os viróides dos citros CV-II e CV-III.
2 - Ocorre segregação de viróides durante os procedimentos de indexação atuais,
inclusive drástica ou total.
3 - As varetas para uso na indexação devem ser coletadas em quadrantes de
acordo com os pontos cardeais e em três diferentes alturas das plantas: a
altura do peito (setor mediano) , do joelho (setor baixo) e no topo das plantas
(setor alto), e, posteriormente, casualizadas conforme o padrão de Greve et al.
(1991).
